降钙素基因相关肽对大鼠主动脉平滑肌细胞HRG

【摘要】目的研究降钙素基因相关肽（cgrp）对大鼠主动脉平滑肌细胞中高血压相关基因（hrg-1）和平滑肌22ɑ（sm22ɑ）表达的影响，为阐明cgrp抑制主动脉平滑肌细胞增殖以及表型转化的机制提供实验依据。方法取健康sd大鼠的主动脉，按照器官培养方法行体外培养血管，he染色和抗5-brdu免疫细胞化学染色观察细胞增殖情况，实时定量rt-pcr检测血管平滑肌细胞增殖相关基因hrg-1和表型转化相关基因sm22ɑ的表达水平，统计分析加cgrp组和未加cgrp组基因表达水平的差异。结果cgrp组增生斑块明显较外源脂质组减少，外源脂质组的血管中膜可见大量被标记的增生平滑肌细胞，cgrp组标记到的增殖细胞明显减少；cgrp组较外源脂质组hrg-1和sm22ɑ表达明显增高。结论cgrp对血管平滑肌增殖的抑制作用与上调增殖负性调控基因hrg-1和收缩表型标志基因sm22α的表达有关。

【关键词】器官模型；平滑肌增殖；降钙素基因相关肽；表型转化；高血压相关基因；平滑肌22α

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.583文章编号：1004-7484（2013）-07-3983-02

降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，cgrp）是一种由37个氨基酸组成的另一种血管活性肽。动物实验表明动脉粥样硬化兔血清中的cgrp明显降低。细胞培养证实，cgrp对人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用，并推断其作用机制是通过抑制周

期蛋白d、e。使vsmc停留于g0/g1期，限制细胞周期进程而达到抑制vsmc增殖[1-3]。然而，cgrp对vsmc表型转化的影响如何还未见报道。本实验通过建立血管平滑肌细胞增殖的器官模型，以cgrp为干预因素，研究cgrp对大鼠主动脉平滑肌细胞中hrg-1和sm22ɑ表达的影响。 1材料与方法

1.1动物150g-200g健康spf级sd大鼠。

1.2主要试剂及仪器cgrp；噻唑蓝（mtt）；兔抗大鼠hrg-1抗体、兔抗大鼠sm22ɑ抗体；山羊抗兔二抗购于武汉博士德公司；标准胎牛血清（fbs）购于杭州四季青公司bca蛋白定量试剂盒购于美国hyclone公司。 1.3实验方法

1.3.1大鼠主动脉血管平滑肌增殖器官模型的建立和实验分组选用体重150g-200g健康大鼠12只，腹腔注射浓度为3.6%的水合氯醛（1ml/100g），取大鼠腹主动脉，用hanks液冲洗三遍，取出血管周围多余脂肪组织，剪成2.5cm左右小段，随机分成3组：a、b、c，每组两段血管。a组用含有cgrp（终浓度为2×10-7mol/l）和ox-ldl（终浓度50μg/ml）的培养液培养，b组用含有ox-ldl（终浓度50μg/ml）的培养液培养；c组用新取出大鼠主动脉，不予培养。以上步骤所制备材料供h-e染色和抗5-brdu免疫细胞化学染色所用。

1.3.2细胞增殖情况的测定h-e染色和brdu标记的免疫组织化学

观察细胞增殖情况。每一批免疫组化均设已知阳性对照和用pbs代替一抗的空白对照。5-brdu阳性表达定位于细胞核。评分标准：全部阴性细胞为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%-50%为2分；51%-75%为3分；>75%为4分。染色强度：0分为无染色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为深棕色。免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积0-1分为阴性（-）；2-3分为阳性（+）；4分以上为强阳性（++）。

1.3.3real time rt-pcr检测目的基因取材方法及培养方法同上。称重（约50mg）后将其剪成小块，放入预冷的研钵内快速研磨、匀浆，直至匀浆液变成无颗粒透明液体。进行总rna提取、纯度和完整性检测。参照说明书进行逆转录反应，反应结束后，实验数据用系统自带的sds软件（v1.4）进行分析。相对定量实验使用的分析方法为比较ct值法。ct值表示阈值循环，是荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。根据公式：△△ct=[目的基因-内参基因]实验组样品-[参照样品基因-内参基因]对照组样品，本文实验采用△ct最大的样品组为参照组。计算实验组样品相对于对照组基因的表达量2-△△ct。

1.4统计学处理实验数据均以均数±标准差（χ±s）表示。实验数据资料统计采用统计学软件spss for windows 13.0。两组间比较用独立样本t检验。p0.05差异无统计学意义。 2结果

2.1he染色和免疫组化观察血管壁平滑肌细胞的增殖情况正常对

照的未予培养组（c组）管壁未见增厚，其余各组均见管壁增厚，其中加了cgrp的a组较未加cgrp的b组增厚程度明显减弱且标记到增殖细胞减少。免疫组化检测vsmc增殖显示a组呈阴性（-），而b组呈强阳性（++）。

2.2real time rt-pcr检测hrg-1、sm22a的表达情况首先分别求出每个样品中3个重复孔目的基因，hrg-1、sm22α和内参基因18s rrna的平均ct值后，应用内参基因18s rrna对各实验组样品进行校正（△ct），再取其对数，对于hrg-1、sm22α表达的差异，分别在a组和b组之间进行比较，见表1、表2。比较hrg-1、sm22α在样本中的表达差异然后对各组的样品的△ct进行归一化处理（△△ct），最后根据△△ct算出各组样品与对照组样品间hrg-1，见表3。sm22的表达差异，见表4。 3讨论

本文通过brdu标记和对hrg-1检测再次证实cgrp对血管平滑肌有抑制作用，cgrp对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的机制之一可能是通过上调hrg-1来实现。hrg-1是一个平滑肌增殖通路中的负性调控基因，对这一基因的深入研究对控制血管平滑肌增殖有重要意义。本文实验用cgrp作用血管平滑肌增殖器官模型，通过brdu标记细胞增殖和检测hrg-1的表达，发现cgrp对增殖模型中vsmc增生有明显的抑制作用，明显上调hrg-1基因的表达，两条途径验证的结果是一致的。

vsmc发育与分化是一个极其复杂的多基因调控过程。研究证实

[4]，心血管疾病所伴随出现的vsmc增殖、迁移及表型转化等一些细胞事件与vsmc分化过程有许多相似之处，因此，探讨vsmc发育分化的调控机制将有助于揭示此类心血管疾病的病理本质。平滑肌细胞具有收缩型和合成型两种表型，不同表型的细胞具有不同的生物学特性和功能，收缩型vsmc呈分化状态，有较强的弹性，可以维持血管的生理功能，不能增殖；合成型vsmc呈去分化状态，核糖体和高尔基体等细胞器增多，合成和分泌功能增强，同时收缩功能消失，对外界各种有丝分裂原起反应而活跃增生[5]。增殖的合成型细胞可以从血管的中膜迁移至内膜并分泌大量的细胞外基质，并成为引起as和血管再狭窄等血管性疾病的主要原因。既然引起vsmc发生增殖的主要原因是vsmc发生了由一系列生长因子和细胞因子引起的表型转变，使vsmc由收缩型转变为合成型，因此如何防治和逆转vsmc向合成型转变就成为近年来研究的热点和难点。sm22α经常作为一种分子模型被广泛用于vsmc基因表达调控的研究。cgrp抑制平滑肌细胞增殖有报道，而cgrp对平滑肌细胞表型转化的影响还未见文献报道，本文观察了cgrp对大鼠血管平滑肌细胞sm22α基因表达的影响，实验结果表明：cgrp可明显上调vsmc中sm22α的表达，这与平滑肌表型转化是平滑肌增殖的初始步骤理论相吻合。关于cgrp对血管平滑肌细胞表型转化的作用机理还有待进一步研究。 参考文献

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