凯氏定氮

1.适用范围：所有动植物样品 2.原理：

蛋白质中的有机氮经消化后成为无机氮，通过测定无机氮的含量，折算出蛋白质的含量。 此法测定的是粗蛋白的含量（包括蛋白质氮和非蛋白质氮，如生物碱、核酸中的N，若非蛋白氮较少，可估算蛋白质量，非蛋白氮较多，可将蛋白质用盐沉淀，再测定，较准确）。最低检出量为0.05mg氨，相当于0.3mg蛋白质。 样品消化

有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 2NH2 (CH2)COOH+13浓H2SO4 (NH4)2SO4 +6CO2+12SO2+16H2O 其中浓H2SO4（其他的酸或稀酸都不可以） 1）脱水作用（将蛋白质炭化成C、H、N） 2）氧化作用

硫酸使有机物脱水，破坏有机物C与H转化为二氧化碳和水挥发，蛋白质分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。

为了加速消化，可加入CuSO4作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高溶液的沸点。此外硒汞混合物或钼酸钠可作为催化剂，且缩短作用时间，H2O2也可加速反应。

硫酸钾加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点为330摄氏度，而添加硫酸钾后温度可达400摄氏度，加速了整个反应过程，此外也可以加入硫酸钠，氯化钾等盐来提高沸点，其理由是随着消化过程硫酸不断被分解、水分的逸出而使硫酸钾的浓度上升，沸点上升，加速有机物分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸铵也会分解，放出氨而造成损失。为了加速反应过程，还加入硫酸铜，有机物全部消化后，出现硫酸铜的蓝绿色，可作为酸碱指示剂。 蒸馏和吸收：

在凯氏定氮仪中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，由H3BO3 吸收 (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 滴定

用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

指示剂：碱性呈绿色，中性呈灰色，酸性红色。混合指示剂，颜色变化更加明显。 3.测定方法

一、消化

1．用微分天平准确称取一定质量的样品，置于消化管底部。对于固体或是半固体等可用称量纸称量的样品，可将称量纸置于消化管中（称量纸不含氮，不会影响结果）。不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

每个样品2—3个平行。设置2—3个空白实验（不加样品）。样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

一般称取：固体 0.20~2.00g 半固体 0.5~2.00g 液体 1.00~10.0ml 注：因操作不当残留在管壁上的样品，在加入硫酸的时候需用硫酸将其冲入消化管底部，否则将造成测定结果偏低。

2．加入0.3克的催化剂（CuSO4与K2SO4混合物）。

3．加入一定量的浓H2SO4，在通风橱中操作，盖上小漏斗。（举例，蛋白质含量20%左右的干酪0.6g所加浓H2SO4量为10ml。）

注：浓H2SO4的添加量要考虑样品组成对消耗酸量的影响。酸量小，样品消化不完全，测定结果偏低；酸量大，定氮过程中与碱中和后酸过量，游离氨不能被蒸馏出来，严重影响测定结果。

消化时由于会放出SO2，因此须在通风橱中操作，

4．消化：在280℃预消化1h，然后将温度升高到400℃下进行消化至溶液澄清。

注：a．预消化的目的是让样品和硫酸先缓慢的反应。不预消化，浓硫酸将和样品在高温下剧烈反应，造成炭化，测定结果将偏低；炭化造成的颗粒还将会在排废过程中堵塞管路，造成仪器不能正常工作；

b．消化管中液体冷却后不返黄为消化终点，否则需继续消化。

c. 样品中含有脂肪或糖类较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火。

消化时间应掌握好，时间过长造成氨的损失，消化不够，结果偏低；视不同样品含脂肪、蛋白而定，一般样液呈绿色后继续消化30min就可以了。

二、定氮 1．用蒸馏水将小漏斗的内壁润一下，使吸附在内壁上的液体进入消化管中，以备定氮所需。但是，蒸馏水用量不能过大，否则蒸馏水中的氮会对结果产生影响。 2．检查蒸馏水、碱液、指示剂的量，保证各个溶液能够满足实验所需。 指示剂配置：称取甲基红0.5g，溴甲酚绿1g，用95%乙醇分别溶解后混合，定容至300ml；配置2%硼酸水溶液3—5 L加入到硼酸桶中，再把甲基红-溴甲酚绿混合指示剂与2%硼酸溶液按比例1:100加入硼酸溶液中，混合均匀，拧紧桶盖。

碱液配制：碱液的浓度为33%—35%，一瓶未开封的NaOH（500g）加入1L水；

注：NaOH溶液在配制时会释放大量的热，应在通风橱中操作。用大塑料杯子配制，先在杯子中加入水，将杯子放入冷水浴中，边搅拌边加入NaOH固体。待冷却之后，再倒入塑料桶中。

3．酸液配制：

a．根据称取样品质量，确定所配酸液的浓度，确保定氮所用酸量在15—25ml。举例，蛋白质含量20%左右的干酪0.6g所需HCl浓度为0.1mol/L。 b．0.1mol/L的HCl溶液配制：9.0ml浓盐酸，稀释到1L。

c．0.1mol/L的HCl溶液标定：三角瓶中加入0.1g左右Na2CO3（微分天平称量，准确记录读数），加入50ml蒸馏水，用配制的HCl溶液滴定。根据滴定体积，计算HCl准确浓度（精确到小数点后第四位）。 4．将冷却水开关打开。

5．进入到凯氏定氮仪界面，显示“R”。先按手动操作，再按手动选择，出现的参数分别代表：

HB：硼酸； HA：碱； HD：蒸馏水； HT：酸液； HE：废液 6．换酸操作：

a．将白色的管子拧下来，将其中的HCl倒掉后再装上；

注：拧管子的时候要注意，不能将管子拧得太紧或是太松，太松容易漏液对仪器造成污染，太紧则不容易下次操作。要掌握好力度。 b．按手动选择，选择“HT”，按手动操作，让新换的酸液在管中润洗两次。 7．开始定氮操作，按手动选择，选择“AUTO”，按参数设置，出现的参数分别代表： No：样品号； M：滴定所用酸浓度； K：1.0000（常数，不用设置）； A：加碱液时间； C：定氮系数（奶制品设置为6.38，蛋制品设置为6.25）； W：样品质量； V0：空白滴定体积（三次空白实验消耗酸液的平均值）；

注：加碱液时间，空白实验不用设置，样品组设为4s或5s，需保证加碱正常或过量。正常时为土黄色，过量时为蓝色。 8．，首先进行空管实验，参数设置完成后，按自动测定。一般一次定氮实验的时间为4—5min。完成后，打开盖，带着厚手套，将其中的液体倒入废液缸中。空管实验是为了检测仪器的稳定程度。当前后3次滴定酸值稳定时，可认为仪器稳定。

9．仪器稳定后，开始空白管实验，更改参数后，拉下盖子即开始滴定实验。空白实验是为了排除加入试剂的干扰。定氮结束后，记录所用酸值。并将三次空白实验的滴定酸值取平均，作为空白滴定体积V0。

10．样品溶液的凯氏定氮，此时需要设定V0：空白滴定体积，之后方法依旧。 11．实验结束后，关上开关，关掉冷却水，并将废液缸中的液体倒入厕所。 三、含氮量计算 含氮量计算公式：

N (%) = 1.401 × M × (V－V0) / W 粗蛋白含量计算公式： P (%) = N (%) × C

式中，M—标准酸摩尔浓度 W—样品质量（g）

V0—空白滴定标准酸消耗量 V—样品滴定标准酸消耗量 C—定氮系数