高丽萍 潘红锋 蔡增轩 任一平 浙江省疾病预防控制中心 中国浙江省杭州 310009
【摘要】 本实验采用超高压液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）法，以多离子反应监测（MRM）为扫描方式，通过对样品预处理、色谱条件、质谱参数等的摸索与优化，建立了一种简单、快速并且可靠的检测饲料中三聚氰胺的方法。本实验采用AcQuity UPLCTM BEH C18 (100×2.1mm I.D., 1.7µm) 分离柱，水和甲醇为流动相。该方法灵敏高，稳定性和准确度均较好，经方法鉴定实验，三聚氰胺定量限（LOQ）为5.0μg/kg（进样量10μL）；通过校正曲线作回归方程，在10～300ng/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数r2为0.99；日内精密度RSD值为6.98%，日间精密度RSD值为5.96％；回收率为90～100%。本实验并对基质抑制效应作了一定研究。
【关键词】 UPLC-MS/MS，三聚氰胺，动物饲料
1. 前言
三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 是一种重要的氮杂环有机化工原料。三聚氰胺分子式为C3N6H6，结构式见图1，呈弱碱性，能溶解于甘油、吡啶、热乙二醇、乙酸、甲醛等有机溶剂，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸和强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰胺二酰胺，三聚氰胺一酰胺和三聚氰酸，在某些微生物的代谢下，也能发生上述反应。
NH2NNH2NNNH2
图1三聚氰胺(melamine)
三聚氰胺作为一种塑料化工常用材料，作为食品添加剂并没有实际作用，更没有任何营养价值。但因其一个碳原子上含有3个氮，而普通蛋白质中一个碳原子上仅含有一个氮，目前我们所常用的测蛋白质含量方法为定氮法，是通过测定氮原子含量来推算蛋白质含量。因此食品中添加此种物质可以“提高”蛋白质含量，从而降低生产成本，达到盈利的目的。
2007年3月, 美国发生宠物食用含有三聚氰胺的食品导致死亡的事件，2007年4月，FDA公布了HPLC-UV和GC-MS检测三聚氰胺的方法。近日，在美国加利福尼亚斯坦尼斯洛斯郡的一个农场的饲养猪的尿液里发现了化学成分三聚氰胺。同时，在猫、狗食用宠物饲料后中毒死亡的案例中，从回收的产品主原料小麦蛋白，以及病猫尿液及肾脏中也化验出了该物质。目前，尚未确定三聚氰胺到底存在怎样的毒性，但是它确实能够使动物肾衰竭和肾结石并导致死亡。在喂养宠物饲料的老鼠体内发现的肾结石的主要成分就是三聚氰胺和尿酸，三聚氰胺就形成于尿素，因此三聚氰胺禁止用于宠物食品及动物饲料。同时，该物质也可能通过食物链影响人体的健康。
美国食品和药物管理局证实，在小麦蛋白、大米浓缩蛋白以及南非的玉米蛋白中都发现了三聚氰胺，而这些都是从我国进口的宠物粮原料。该问题引起了美国的强烈关注，也在中
国境内造成了不小的波澜，这将在一定程度上影响我国农作物和宠物粮原料的出口贸易。因此，为了严格控制宠物饲料的品质，有必要建立一种准确测定食品中三聚氰胺含量的方法。
现有的三聚氰胺测定方法主要有光谱法（Spectroscopy）、色谱法（Chromatographic）和色谱-质谱（Chromatographic-MS）联用检测法等。
1995年Martine L. Scheepers等[1]运用拉曼光谱法分析了三聚氰胺甲醛树脂中三种三聚氰胺成分，且样品不需要任何前处理。
高效液相色谱（HPLC）结合紫外检测器法因其灵敏度高、自动化程度高、检测限低等优点在国际上得到了最为广泛的应用。1990年Takiko Sugita[2]用HPLC-UV法检测了三聚氰胺及其三种代谢产物。采用Zorbax氨基柱(25cm×4.6mm I.D.，5μm)，以水78％乙腈水溶液和22％5mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.7)作为流动相。在其中加入煮沸30min的4％乙酸以加强其灵敏度，LOQ达到0.02ng/ml。2000年Robert A. Yokley等[3]用70/30的乙腈-碳酸铵溶液提取土壤中的三聚氰胺，离心后，再经过处理，进样，用LC-UV法检测三聚氰胺的残留量，其LOQ为10ng/ml。
色谱-质谱联用检测法是近几年兴起的新技术，与其他方法相比较具有更高的选择性和灵敏度。1987年Toth, J. P等[4]运用毛细管气相色谱-质谱法，以阿灭净作为内标，检测了三胺嗪及其代谢物三聚氰胺。气相分离柱为fused-silica DB-17柱(15cm × 0.32 mm)，质谱采用EI单离子选择模式，方法的检测限达到了0.3ng。2005年J.V. Sancho等[5]应用离子对色谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)联用技术检测甜菜中的赛灭净和它的代谢物三聚氰胺，由于这两种农药都是弱极性碱性分子，这使检测工作变得复杂。实验中，使用添加了磷酸盐缓冲液的甲醇萃取液并高速搅拌，tridecafluoroheptanoic acid(TFHA)作为离子对试剂，萃取液只用水稀释一倍后，便采用LC-ESI-MS/MS进行检测分析。两种农药的检测限均低于0.01mg/kg，赛灭净和三聚氰胺的回收率分别为92％、78％。
LC-MS/MS联用技术操作简单，准确度好、灵敏度高，测定时间短，可提供可靠的、精确的相对分子量和结构信息，是测定痕量物质的理想方法。应用LC-MS/MS联用技术测定食品中三聚氰胺的国内外文献均未见报道。
本实验采用超高压液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS）法，建立了一种快速并且可靠的检测食品中三聚氰胺的方法。本方法可适用于各种动物饲料中三聚氰胺的测定，且具有前处理简单的优点。
2. 实验材料与方法 2.1 仪器
ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪（Waters公司），Micromass Quattro Ultima TM Pt 质谱仪（Waters公司），BECKMAN AvantiTMJ-20XP 高速离心机，Milli-Q水纯化系统（法国Millipore公司），涡旋混合器，BECKMAN Allegra X-22R离心机，AUTO SCIENCE MTN-2800W氮吹仪 2.2 试剂
三聚氰胺标准品 纯度：99% (W/W)；甲醇，乙腈，购于Merk公司，均为色谱纯；超纯水。
2.3 标准溶液配制
2.3.1 标准储备液：将三聚氰胺标准品用超纯水配制成浓度0.1mg/mL作为储备液，在0℃以下避光保存。
2.3.2 标准工作液：用超纯水将储备液稀释分别成10μg/mL和1μg/mL的溶液作为标准工作液。
2.4 色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100mm，粒径1.7
μm）；柱温：35℃；样品温度：25℃ ，进样体积：10µL；流速：0.3mL/min；流动相A：超纯水；流动相B：甲醇；色谱梯度洗脱条件见表1。 表1 色谱梯度洗脱条件
时间（min）
流动相A %
流动相B%
2 2 100 100 2 2
梯度变化曲线
6 1 6 1 6 1
Initial 98 3 98 3.5 0 4.5 0 5 98 8 98
2.5 质谱参数
2.5.1 离子源：ESI+；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：35V；离子源温度：120℃；RF透镜1：50.0；光圈：0.5；RF透镜2：0.9；锥孔反吹气流量：50 L/hr；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：550L/hr；碰撞池压力：3.0×10-3mbar。
2.5.2 质量分析器：低端分辨率LF Lens1: 12.5V；高端分辨率HM Lens1：12.5V；离子能量1：0.6；入口透镜电压：0V；碰撞梯度：1；出口电压：0V；低端分辨率LF Lens2:12.5V；高端分辨率HM Lens2: 12.5V；离子能量2:2.0 eV。 2.5.3 质量条件参数详见表2。 表2 质量条件参数
离子
三聚氰胺
质量数
碰撞能量(eV) 离子源
母离子 127.3 / ESI+ 定量子离子 85.3 8 ESI+ 定性子离子 68.0 10 ESI+
2.6 样品预处理方法
准确称取0.5g样品于50ml的离心管中，加入10mL乙腈溶液，在旋转式摇震荡器中摇震1min。充分混匀后，将离心管置入超声波中超声提取5min，放入高速离心机14000rpm下离心5min，取上清液2mL，45～50℃下氮气吹干，2mL甲醇溶解残留物，涡旋混匀，15000 rpm离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样。 3. 结果与讨论
3.1 色谱条件的选择 3.1.1 色谱柱的选择
由于本实验只需分离一种物质，故对色谱柱的分离效率并无很高要求。但是，三聚氰胺是一种强极性的物质，一般在色谱柱上的保留时间较短，而在分析样品时，一些极性和小分子物质会在较早时间出峰，干扰待测物。我们就需要选择合适色谱柱使其保留时间尽可能的延长。本实验使用同一浓度的三聚氰胺标准溶液，采用三种普通MS柱与三种UPLC柱分别进行分离（柱1：Waters Xterra C18，2.1×150mm，粒径5μm；柱2：Waters Sunfire C18，2.1×150mm，粒径5μm；柱3：Waters Antilants C18，2.1×150mm，粒径5μm；柱4：Waters ACQUITY UPLC BEH C8，2.1×100mm，粒径1.7μm；柱5：Waters ACQUITY UPLC Shield
C18，2.1×100mm，粒径1.7μm；柱6：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50mm，粒径1.7μm），比较出峰效果（见图2）。
实验结果表明：采用柱4和柱5时，三聚氰胺的保留时间太短；采用柱1和柱2时，灵敏度与其他色谱柱相比显得较低，故不采用这4种柱子。从图4中看出，柱3和柱6的分离效果并无太大差异，而两者的信噪比也相接近。普通MS柱与UPLC柱相比粒径大，压力小，柱填料粒径为5μm，而 UPLC柱仅为1.7μm，单位体积内的表面积大大增加，使柱效显著提高，尽管长度比普通MS柱缩短了三分之一，但仍然能得到完全的分离，而且又能大大缩短分离所需的时间。因此超高压液相色谱柱具有极高的柱效和极快的分离速度，而且其最适流速0.2～0.3mL/min与电喷雾离子化方式流速的要求恰好相符。故本实验选择了柱6即Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50mm，粒径1.7μm）柱用于分离。
图2 色谱柱的选择
3.1.2 流动相的选择
流动相的选择除考虑色谱系统分离效果外，同时必须注意组分进入质谱前离子化的效率，以获得最佳的分离度和最高的灵敏度。本实验采用同一浓度的三聚氰胺溶液，比较了不同的流动相（见图3）。由于三聚氰胺易溶于甲醇和乙腈，本实验分别选择甲醇（a）和乙腈（b）作为流动相B，从图3中可以看出，选用甲醇和乙腈作流动相B时，两者相对丰度相近，灵敏度相同，但是保留时间存在差别，用甲醇作流动相时三聚氰胺的保留时间明显长于用乙腈作流动相时的保留时间。故本实验选择甲醇作为流动相B。
分别选择纯水(b)，10Mm醋酸铵谁溶液(c)，0.1%氨水(d)，0.1%甲酸水溶液(e)作为流动相A。实验结果显示：当以纯水作为流动相时，三聚氰胺的出峰时间晚于用其他溶液作为流动相的出峰时间。同时，纯水对三聚氰胺的灵敏度也明显高于其他三种溶液。故本实验选择纯水作为流动相A。
3.1.3 流动相洗脱条件选择
本实验采用纯水与甲醇作为流动相，进行液相色谱恒定和线性变梯度分离测定，从试验结果可见：采用恒梯度洗脱比线性变梯度洗脱更为优越，因为三聚氰胺的极性使其在线性变梯度洗脱条件下更早的出峰。
对于三聚氰胺来说，100％纯水洗脱是最为理想的洗脱条件，但是Waters ACQUITY UPLC BEH C18这一柱子并不适宜采用100％的纯水作为流动相，故采用恒梯度洗脱的同时，以2％乙腈水溶液作为初始流动相，洗脱条件见表1。
相对丰度％
图3 流动相的选择
3.2 质谱条件的选择 3.2.1 母离子的选择
选用ESI（+）和ESI（-）作为电离化模式，通过直接进样一定浓度的三聚氰胺水溶液，在优化质谱参数和选择标准溶液种类的基础上，确定其母离子质量数。实验结果发现：在离子源ESI+电离条件下，三聚氰胺的母离子峰为[M+H]+，最终选择的母离子见表2。 3.2.2 子离子的选择
在确定三聚氰胺的母离子后，使用Daughter扫描的方式选择特征离子，随着碰撞能量的不断增加，选择丰度较大的两个子离子分别作为定量离子和辅助定性离子，并确定其最佳诱导碰撞能量的范围，最后在MRM方式中进一步调整碰撞能量，选择子离子丰度最高的碰撞能量作为最佳碰撞能量。最终所选择的特征离子和碰撞能量详见表2。
三聚氰胺的裂解原理见图4。
图4 三聚氰胺的裂解示意图
3.3 预处理的优化
本实验样品预处理的关键因素是减少杂质干扰，这就需要选择合适的预处理方法以尽可能的减少杂质的干扰。
3.3.1 提取液的选择
我们必须选择合适的提取液在获得较好提取效率的同时，也可尽可能的沉淀饲料中的蛋白以减少其对待测物测定的干扰。由于高氯酸、甲醇和乙腈都有较好的沉淀蛋白的效果，故本实验分别选选用了0.1Mm高氯酸水溶液、甲醇、乙腈作为提取液，加入1µg标准品，进行2.6的操作。实验结果表明，选用乙腈作为提取液时，三聚氰胺的响应值明显高于其他两者。三聚氰胺在强酸下易水解，使得其在高氯酸提取的条件下测得的相应值很低，实验中也发现，当以甲醇作为提取液时，得到的三聚氰胺峰会出现分叉的现象。故选择乙腈作为最终的提取溶剂。结果详见图6。
提取液的选择6000050000峰面积400003000020000100000高氯酸甲醇提取溶剂乙腈
图6 提取液的选择
3.3.2 MCX柱净化
准确称取2.0g样品于50ml的离心管中，加入1µg标准品，再加入10mL乙腈溶液，在旋转式摇震荡器中摇震1min。充分混匀后，将离心管置入超声波中超声提取5min，放入高速离心机14000rpm下离心5min，取上清液5mL，加入1mL0.03M乙酸，作为上样液，按3．3．1操作，以水定容。同时做空白平行，并以空白基质作为定容液，配制100ppb三聚氰胺标准品，进样。从实验结果可以看出，以过柱净化后的空白基质作为定容液得到的峰面积与以未过柱的空白基质作为定容液得到的峰面积相接近，说明MCX柱净化这一步骤对减少基质干扰，增高回收率并无实际意义。因此在本课题中，未采用MCX柱净化方法，而采用2．6的步骤。（结果见图7）
样品过MCX柱净化160000140000120000100000800006000040000200000sample spikeblank+standard峰面积未过MCX柱过MCX柱
图7 MCX柱的净化效果比较
3.3.3 Al2O3柱
准确吸取10µg/ml的三聚氰胺标准溶液100µl，加入5ml乙腈，作为上样液。Al2O3柱用
5ml乙腈，加上样液过柱，直接收集滤液，并用2ml乙腈淋洗。再氮气吹干，最后用水定容至1ml，进样。结果表明，经过Al2O3柱净化后的三聚氰胺溶液在质谱中无响应信号，说明Al2O3在吸附杂质的同时，对三聚氰胺也几乎全部吸附，因此Al2O3柱不适合作为本实验的固相萃取柱。
3.3.4 定溶液的选择
吹干后的定容液会直接影响待测物的离子化效应及其灵敏度。一般而言，都以初始流动相作为定容液，因本课题的流动相为纯水和甲醇，故本实验选择不同比例的甲醇水溶液作为定容液来比较效果。实验结果显示，随着定容液中甲醇比例的增高，三聚氰氨的相应值也不断增大，当以100%的甲醇定容时，峰面积达到最大值，有利于对三聚氰胺的检测。故选择甲醇作为最终定容液（详见图8）。
定容液的选择120000100000峰面积80000600004000020000001030507090100甲醇百分比
图8 定容液的选择
3.3.5 提取溶剂和样品量的比例关系
饲料样品中的杂质对三聚氰胺的提取存在较大的影响，为了尽量减少该影响，增大提取效率，我们做了提取溶剂和样品量的比例关系的实验。分别称取0.5g、1.0g和2.0g样品，进行2.6的操作，同时平行做空白对照，以空白基质作为定容液，配制100ppb的三聚氰胺的标准溶液。实验结果显示，当称样量越少时，基质干扰越小，三聚氰胺的信号越高，故选择0.5g作为称样量。
称样量与提取液的比例关系500000400000峰面积30000020000010000000.5g1.0g称样量2.0g
图6 称样量与提取液的比例关系
spike blank+standard3.4 方法学验证 3.4.1 标准校正曲线
按2.6的步骤，配制浓度分别为5，10，20，50，100，200，300ng/ml的三聚氰胺基质加标溶液，进样进行分析。以三聚氰胺的峰面积为纵坐标，三聚氰胺浓度为横坐标，获得浓度范围在5～300ng/ml的标准校正曲线。其相关系数r2为0.995，回归方程为Y＝1065.47X＋802.915。(详见图7)
图7 线形回归方程
3.4.2 检出限和定量限
当信噪比为3倍时的溶液浓度为最低检出限，当信噪比为10倍时的溶液浓度为定量限，三聚氰胺至今尚未制定明确的最高限量标准。故只要本实验的灵敏度足以能够检测出一定含量的三聚氰胺即可。本方法的检出限（LOD）为1.6µg/kg，定量限（LOQ）为5.0µg/kg。 3.4.3 回收率试验
取样品15份，每份0.5g，分别加入高、中、低不同浓度的三聚氰胺溶液，各5份，按2.6方法进行前处理，进行检测，结果见表3。由表3可见，平均回收率在90～100%之间，且高、中、低各浓度五次重复均获良好的重现性。
表3 回收率实验
名称 三聚氰胺
理论加入量（mg/kg）
实际测得量（mg/kg）
回收率 (%)
RSD (%)
0.2 0.1950 97.52 3.26 1.0 0.9424 94.24 6.98 2.0 1.9654 98.27 7.55
3.4.4 精密度试验
3.4.4.1日内精密度
日内重复取上述样品5次，加入50µg三聚氰胺标准品，按2.6样品预处理方法进行处理，依次进样检测。结果见表4：
表4 日内精密度
序号 1 2 3 4 5
三聚氰胺
1.0203 0.8381 0.9464 0.9613 (mg/kg) 0.9465 RSD %
6.98
3.4.4.2日间精密度
取上述试验样品，每天取样5份，连续5天，加入100ng三聚氰胺标准品，按2.6样品预处理方法进行处理，依次进样检测。结果见表5： 表5 日间精密度
序号 1 2 3 4 5
三聚氰胺 (mg/1kg) RSD%
1.8256
1.9637
2.1431 5.96
1.9224
2.0182
3.5 样品检测
对实际样品按照2.6的预处理方法进行检测，得到数据结果。见表6 表6 检测结果
样品序号 1
三聚氰胺含量 (mg/kg)
7.88
4.结论
本文建立了超高压液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法检测动物饲料中三聚氰胺含量的理想方法。该方法样品前处理方法简单，不需经过固相萃取等步骤，只经超声提取，氮气吹干，甲醇定容，直接用滤膜过滤即可进样检测，且重现性和回收率均良好。
三重四级杆质谱的多离子反应监测(MRM)方式可获得极高的检测灵敏度。第一级质谱选择了特征母离子，经碰撞能量优化后，第二级质谱选择了特征子离子，只有同时具有这两种特征的离子质量才被记录，杂质干扰的可能性极低。
经方法学验证，本方法可适用一般动物饲料中三聚氰胺含量的测定，具有快速、简单、准确、灵敏度高、分析周期短等优点。
当然本方法仍存在一定不足的地方，如检测食品中三聚氰胺的残留量，这需要在以后的工作中不断完善。 5、参考文献
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