(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112760413 A(43)申请公布日 2021.05.07
(21)申请号 202110303536.0(22)申请日 2021.03.22
(71)申请人 苏州大学
地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8
号(72)发明人 孙万平 张玲 钱利祥 丁威
方坛芬 韩蓉 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有
限公司 32103
代理人 孙周强 陶海锋(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图7页
CN 112760413 A(54)发明名称
公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用(57)摘要
本发明公开了公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，具体检测我国农业农村部允许进口的6种转基因大豆。在
,
每对特异性引物的5’端均加上一段公共引物,形成特异性嵌合引物。多重PCR检测体系扩增出特异性片段，GeXP检出各转基因大豆片段长度，GeXP多重检测体系检测敏感性可达到为1 ng/µL;扩增产物测序结果进一步说明了引物扩增的特异性。本发明建立的基于GeXP系统的多重PCR定量检测技术,可以准确鉴别6种转基因大豆,为转基因大豆及其他转基因产品提供了新型的检测方法。
CN 112760413 A
权 利 要 求 书
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1.公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，其特征在于，提取待检测产品基因组DNA作为模板，在嵌合引物与荧光公共引物存在下采用两步退火温度法进行PCR反应，对PCR产物进行GeXP系统检测即完成产品中转基因大豆成分的检测；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1，在其5’端进行荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，其特征在于，所述嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.13。
3.根据权利要求1所述公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，其特征在于，进行PCR反应时，升温程序为95℃预变性 5min；95℃变性30s，62℃退火10s，56℃退火20s，72℃ 延伸30s共10个循环；然后72℃ 预变性2min；95℃变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。
4.根据权利要求1所述公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，其特征在于，进行PCR反应时，采用25微升体系，其中公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF 52.8nM、D6SR 52.8nM、CVSF 24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、M05SR 40nM、M08SF32nM。
5.根据权利要求1所述公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用，其特征在于，所述产品为包含大豆成分的食品或者饲料、保健品、药品。
6.嵌合引物与荧光公共引物在多重定量PCR检测产品中转基因大豆成份中的应用；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1，在其5’端进行荧光染料标记。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.13。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，转基因大豆的品种为MON7701、DP356043、CV‑127、MON87769、MON87705和MON87708。
9.利用公共引物介导的多重定量PCR检测技术进行产品中转基因大豆成分检测的方法，其特征在于，包括以下步骤，提取待检测产品基因组DNA作为模板，在嵌合引物与荧光公共引物存在下采用两步退火温度法进行PCR反应，对PCR产物进行GeXP系统检测即完成产品中转基因大豆成分的检测。
10.多重定量PCR检测转基因大豆用试剂盒，包括嵌合引物与荧光公共引物；所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1，在其5’端进行荧光染料标记；所述嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.13。
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公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中
的应用
技术领域
[0001]本发明属于转基因大豆检测技术，具体涉及公共引物介导的多重定量PCR检测技术研究及在转基因大豆检测中的应用。
背景技术
[0002]转基因食品的安全问题一直是社会的热点问题, 建立一种能够鉴别这些转基因食品的高通量检测方法对消费者的知情权具有重要的意义。核酸检测是转基因食品检测的主要技术和未来发展的必然趋势, 食品核酸检测技术主要包括PCR系列技术(如单重PCR、多重PCR及荧光定量PCR等)、数字PCR技术、Southern杂交、恒温扩增技术、基因芯片技术及高通量测序等。由于受检食品成分不明确, 目前针对食品核酸检测技术主要采用多重PCR、荧光定量PCR、基因芯片和高通量测序技术。荧光定量PCR技术因荧光检测通道限制, 检测靶标一般在6种以内。基因芯片技术及高通量测序主要应用于人体的基因诊断, 技术上可以应用于食品检测, 但食品检测收费低廉, 此技术难以满足食品经济、快速的检测需求。目前, 多重PCR因在一个PCR管中同时检测多个靶标分子, 具有高效性、敏感性、经济和简便性等优点, 在食品安全核酸检测技术中受到广泛关注。然而该技术目前主要用于定性分析, 难以进行定量检测。发明内容
[0003]本发明将多重PCR扩增与GeXP高通量检测结合起来, 在传统PCR的基础上引入荧光标记的公共引物, 在特异性引物与模板结合后, 公共引物与特异性引物结合合成新链, 并作为新的模板链进行扩增。若干个循环之后, 扩增后的产物均带上了荧光标记。通过GeXP系统所提供的DNA Standard Size可获得产物的bp数大小, 对检测样品定性分析; 通过GeXP检测产物荧光信号强度, 如建立标准曲线, 可实现对检测样品的相对含量测定, 实现定量分析, 目前关于此方面的研究相对较少。[0004]本发明采用如下技术方案：
公共引物介导的多重定量PCR检测技术研究及在转基因大豆检测中的应用，提取
待检测产品基因组DNA作为模板，在嵌合引物与荧光公共引物存在下采用两步退火温度法进行PCR反应，对PCR产物进行GeXP系统检测即完成产品中转基因大豆成分的检测。
[0005]本发明公开了利用公共引物介导的多重定量PCR检测技术进行产品中转基因大豆成分检测的方法，包括以下步骤，提取待检测产品基因组DNA作为模板，在嵌合引物与荧光公共引物存在下采用两步退火温度法进行PCR反应，对PCR产物进行GeXP系统检测即完成产品中转基因大豆成分的检测。
[0006]本发明公开了嵌合引物与荧光公共引物在多重定量PCR检测产品中转基因大豆成份中的应用。
[0007]本发明中，所述公共引物的序列为SEQ ID NO.1，在其5’端进行Cy5荧光染料标记；
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所述嵌合引物为SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.13。[0008]本发明中，转基因大豆的品种为MON7701、DP356043、CV‑127、MON87769、MON87705和MON87708。
[0009]本发明中，进行PCR反应时，升温程序为95℃预变性 5min；95℃变性30s，62℃退火10s，56℃退火20s，72℃ 延伸30s共10个循环；然后72℃ 预变性2min；95℃变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸7min。前10个循环，创造性的设计两个退火温度下，低浓度的嵌合引物中特异引物扩增靶标序列，产生带有公共引物末端的PCR产物；后30个循环，在低退火温度（与前循环第二退火温度一致）下，高浓度的公共引物以早期产生的带有公共引物末端的PCR产物为模板进行大量扩增。根据本发明的方法可以有效、简便的检测产品中，尤其是食品中是否含有转基因大豆成分，为国民知情权以及食品安全做出巨大贡献。进行PCR反应时，采用25微升体系，其中公共引物的终浓度为1600nM，针对转基因大豆的嵌合引物对的终浓度如下：M7SF53.6nM、M7SR 53.6nM、D6SF 52.8nM、D6SR 52.8nM、CVSF 24nM、CVSR 24nM、M69SF16nM、M69SR 64nM、M05SR 40nM、M08SF32nM；所述产品为包含大豆成分的食品、饲料等。[0010]本发明依据前期研究建立的“公共引物”介导的多重技术, 通过公共引物5’端标记荧光, 利用所有扩展产物均带有公共引物的特性, 对不同产物片段进行荧光定量分析, 研发适用于食品检测的高通量、高精确性和可靠性的核酸定量检测技术, 并针对我国进口的常见转基因大豆, 包括MON7701、DP356043、CV‑127、MON87769、MON87705和MON87708这6种转基因大豆, 建立了定量检测方法, 为转基因大豆市场监管提供新的检测手段。附图说明
[0011]图1为转基因大豆MON87701特异性和敏感性检测结果，其中A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为1 ng/μL。[0012]图2为转基因大豆DP356043特异性和敏感性检测结果，其中，A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为1 ng/μL。[0013]图3为转基因大豆CV‑127特异性和敏感性检测结果，其中，A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为0.2ng/μL。[0014]图4为转基因大豆MON87769特异性和敏感性检测结果，其中，A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为0.2ng/μL。[0015]图5为转基因大豆MON87705特异性和敏感性检测结果，其中，A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为1 ng/μL。[0016]图6为转基因大豆MON87708特异性和敏感性检测结果，其中，A、B、C、D和E的模板浓度分别为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 最低检测模板浓度为1 ng/μL。[0017]图7为扩增产物测序部分结果。
具体实施方式
[0018]T30DPCR仪、LG2020凝胶成像分析系统、CK‑6常温高速离心机(杭州朗基科学仪器有限公司); BXM‑30R高压灭菌锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司); MICROCL17 离心机、Nanodrop 2000/2000C 分光光度计(赛默飞世尔科技公司); ‒80 ℃低温冰箱(日本
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三洋电器股份有限公司); MSX (SD EE)电子分析天平(瑞士梅特勒‑托利亚公司); DDY‑5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂); DK‑600B电热恒温水槽(上海精宏公司); GNP‑9050隔水式恒温培养箱(上海精其仪器有限公司); BCD‑118冰箱(合肥美菱股份有限公司); Air tech净化工作台(苏净集团有限公司); 5810R低温高速离心机、微量移液器(德国Eppendorf公司); GeXP分析系统(美国贝克曼公司)。[0019]转基因大豆MON87701、CV127、MON87769、MON87708、MON87705粉末标准品(美国油脂化学协会); 转基因大豆DP356043(欧洲标准局); GeXP启动试剂盒、DNA size standard Kit‑400 Base Pairs、分离缓冲液及分离胶(美国贝克曼公司); 离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司); 普通引物(苏州金唯智公司); PCR预混液2×DreamTaqGreen、DNA分子量标准Ladder(美国Fermentas公司); 琼脂粉(北京康润诚业生物科技有限公司); 凝胶染色剂(北京全式金公司); 氯仿、苯酚、无水乙醇(分析纯, 国药集团有限公司); DNA染料(6×DNA Loading Dye, 美国Thermo公司); 荧光公共引物(其5’端
苏州金唯智公司)。转基因大豆插入基因、特性及国标检测方法如表进行Cy5荧光染料标记，
1所示。
实施例
[0020]
依据北京天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒所提供的说明书提取转基因大豆
(MON87701、DP356043、MON87769、CV‑127、MON87705、MON87708)基因组,提取后的DNA保存在‒20 ℃的冰箱。
[0021]各引物如表2所示。
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MON87769的下游引物相同, MON87701与MON87705注: 在这些引物中, MON87708、
的上游引物相同；CP4的5’端进行Cy5荧光染料标记。
[0023]在本实施例UP‑MPCR(公共引物介导的多重PCR)体系中, 内参引物的序列: 上游: GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG, 下游: GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG, 产物长度210 bp, 且不影响多重体系的反应。
[0024]传统PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子作为模板, 同时将一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段作为扩增的引物, 扩增DNA目的片段。公共引物介导的多重PCR, 在传统PCR的基础上引入了公共引物。当特异性引物连接到模板链上之后, 公共引物与特异性引物连接, 从而产生包含公共引物的DNA新链, 嵌合引物的作用主要为后续公共引物扩增提供模板, 后续的扩增可使用公共引物进行PCR扩增, 该扩增原理可大幅降低嵌合引物浓度, 有效降低多重引物间的相互作用, 从而提高多重PCR检测通量。[0025]以12.5 μL 2 × Taq master Mix, 4 μL荧光公共引物, 2 μL嵌合引物(混合液), 1 μL DNA模板, 5.5 μL dH2O 的多重PCR扩增体系进行扩增。将扩增完成的样品作为GeXP的检测对象。CP‑MPCR扩增体系与程序其具体细节如下: 2×Taq master Mix 12.5 μL, 荧光公共引物(10 μmol/L)4 μL, 嵌合引物(混合液)2 μL, DNA template 1 μL, 最后加蒸馏水补足到25 μL。其中, 嵌合引物混合液组成为:M7 F: 6.7 μL R: 6.7 μL; D6 F: 6.6 μL R: 6.6 μL: CV F: 3 μL R: 3 μL; M69 F: 1 μL R: 8 μL; M05 R: 4 μL; M08
ng/μL。荧光公共引物的终浓F: 4 μL。然后用蒸馏水补足到100 μL。初始DNA模板浓度为20
度为1.6 mmol/L, 各嵌合引物对的体系终浓度分别为M7SF/R 53.6 nmol/L, D6SF/R 52.8 nmol/L, CVSF/R 24 nmol/L, M69SF 16 nmol/L、M69SR 64 nmol/L, M05SR 40 nmol/L, M08SF32 nmol/L。在这些引物中, MON87708、MON87769的下游引物相同, MON87701与MON87705的上游引物相同。[0026]CP‑MPCR扩增程序为: 95 ℃(5 min); 95 ℃(30 s), 62 ℃(10 s), 56 ℃(20 s), 72 ℃(30 s); 72 ℃(2 min); 95 ℃ (30 s), 56 ℃(30 s), 72 ℃(30 s); 72 ℃
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(7 min)。其中, 第2个到第4个步骤为10个循环, 第7个到第9个步骤为30个循环。[0027]GeXP多重PCR的特异性检测：
首先, 制备SDS和DSS(DNA Standard Size)混合液:取DSS400, 加入80倍体积的
SLS, 涡旋混匀。接着, 在每个样品孔中加入40 µL混合液, 再加入0.1~1 µL PCR产物, 检查有无气泡, 再加入一滴石蜡油。然后, 在相应的缓冲液盘孔中加入300 µL分离缓冲液。最后, 采用Frag 3(方法的名称,一般为6 kV，40 min)的方法进行分离。仪器检测结束之后, 每个孔都会有相应的峰图, 依据峰图上显示出DSS的结果可读出相应的bp(basepair)数。
[0028]当使用的DNA模板浓度为20 ng/μL时, 测得的产物长度如图1~图6所示, MON87701为140.75 bp, DP356043为184.42 bp, CV‑127为274.93 bp, MON87769为308.47 bp, MON87705为467.98 bp, MON87708为517.67 bp, 该检测体系最小扩增片段为 140 bp, 说明本发明方法特异性好。
[0029]GeXP多重PCR的敏感性检测：
以12.5 μL2×Taq master Mix, 4 μL荧光标记公共引物, 2 μL嵌合引物(混合
液), 1 μL DNA模板, 5.5 μL dH2O 的多重PCR扩增体系进行扩增, 其中DNA模板的浓度由20 ng/μL分别稀释到2、1、0.2、0.02 ng/μL。以这5个浓度分别进行扩增,然后, 将扩增产物放入GeXP系统进行检测, 根据最后得到的图像中是否有峰判断GeXP多重PCR敏感性。将DNA模板浓度分别稀释到20、2、1、0.2、0.02 ng/μL 5个不同浓度, 通过多重PCR进行扩增, 扩增后的产物放入GeXP系统进行检测，结果如图1~6所示,各转基因大豆扩增条带大小和所能检测的最低浓度如表3所示, CV‑127和MON87769 这2种转基因大豆的敏感性达到0.2 ng/μL, 其余4种均达到1 ng/μL, 该检测敏感性可用转基因大豆检测。
注: bp数本来应为整数, 上表所提供的bp数均为GeXP系统根据marker的情况所计算得来, 故出现小数。[0031]扩增产物测序：
为进一步确认扩增产物特异性, 图1~图6中的GeXP系统检测结果体现了各检测片
段的大小与目标扩增片段一致, 为了进一步说明扩增片段即为检测片段, 将PCR反应产物送至苏州金唯智公司测序, 图7为部分测序结果图, 测序结果显示扩增片段序列与各转基因对应序列一致。[0032]对比例
上述本发明公开的引物序列与CN 2018105173895一样，根据CN 2018105173895表
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1的引物，选择6种基因模板进行实施例同样的CP‑MPCR扩增与GeXP系统进行检测，发现结果发生变化，说明引物的选择对检测性能有影响，具体如下：
本发明的创造性不在于引物的设计，而在于6种引物的选择以及扩增后采用GeXP的方法，可以使得部分转基因产品的检测限达到0.2 ng/μL。本发明采用公共引物介导的多重PCR技术, 由于公共引物在检测靶标基因组中没有同源性序列, 因此, 多重PCR引物加上公共引物后对退火温度的影响很小。但每对多重引物5’末端均添加公共引物作为共有序列, 使得多重引物一般在40 bp以上, 在多重引物设计时主要需考虑加上公共引物的多重引物本身是否存在二级结构、引物间是否会有二聚体形成以及引物与模板间的结合效率等。本核酸检测技术与荧光定量PCR技术相比, 只需在公共引物标记一种荧光, 可实现多个扩增产物的定量检测, 不仅突破了荧光定量PCR的荧光检测通道导致的检测通量限制, 同时, 所采用的公共引物标记单种荧光, 方法更加简便、检测成本更低。采用本研究方案, 将MON87701、DP356043、CV‑127、MON87769、MON87705、MON87708 这6个转基因大豆品种作为实验对象, 分别就GeXP对其的特异性与敏感性进行检测。结果显示, 在体系的DNA模板浓度为20 ng/μL时, M7在140.75 bp处有特征峰, D6在184.42 bp处有特征峰, CV在274.93
M05在467.98 bp处有特征峰, M08在517.67 bp处有特征峰, 测序结果显bp处有特征峰,
示均扩增出了目的序列, 使用该系统可对这6种转基因大豆进行特异性识别。当体系中的DNA模板浓度被稀释到2、1、0.2、0.02 ng/μL时, CV与M69在0.2 ng/μL的浓度下仍然可以检测到特征峰, M7、D6、M05与M08最低在浓度为1 ng/μL时可以检测到特征峰, 该系统对这几种转基因大豆的识别具有较高的灵敏度。相较于普通的PCR只能通过凝胶电泳观察结果, GeXP为进一步定量分析研究提供了基础。
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序 列 表
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序列表<110> 苏州大学<120> 公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用<160> 15<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1
ccgcaag 17ctcgtcaact
<210> 2<211> 42<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2ctcgtcaact ccgcaagata ttgaccatca tactcattgc tg 42<210> 3<211> 40<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3ctcgtcaact ccgcaagtca ctttcttgaa ttagcttgct 40<210> 4<211> 37<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4ctcgtcaact ccgcaagctt ttgcccgagg tcgttag 37<210> 5<211> 39<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5ctcgtcaact ccgcaaggcc ctttggtctt ctgagactg 39<210> 6<211> 41<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6ctcgtcaact ccgcaagtgt ataggaaagc gcaaactgat g 41<210> 7<211> 39<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7ctcgtcaact ccgcaagatt agggtttcag caggttcgt 39<210> 8<211> 42<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8ctcgtcaact ccgcaagatg agaagatggt tttttccaag gt 42<210> 9<211> 36<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9ctcgtcaact ccgcaagtgt cgtttcccgc cttcag 36<210> 10<211> 42<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10ctcgtcaact ccgcaagata ttgaccatca tactcattgc tg 42<210> 11<211> 38<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11ctcgtcaact ccgcaagata gggctttgtg ggatctat 38<210> 12<211> 43<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12ctcgtcaact ccgcaagggt aatctaaaca tgcatgagaa atg 43
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序 列 表
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<210> 13<211> 36<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13ctcgtcaact ccgcaagtgt cgtttcccgc cttcag 36<210> 14<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)
14<400>
gggtgaggat agggttctct g 21<210> 15<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 15gcgatcgagt agtgagagtc g 21
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图1
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