(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110393183 A(43)申请公布日 2019.11.01
(21)申请号 201810373625.0(22)申请日 2018.04.24
(71)申请人 天津农学院
地址 300384 天津市西青区津静公路22号(72)发明人 郝志明 刘新峰 胡德宝 朱菲菲
张荧 王福兄 王宝英 (74)专利代理机构 天津创智天诚知识产权代理
事务所(普通合伙) 12214
代理人 王秀奎(51)Int.Cl.
A01N 1/02(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页 附图1页
(54)发明名称
稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用(57)摘要
本发明公开稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用，由Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、青霉素、链霉素和水组成，每100ml水中，Tris 3—5质量份、柠檬酸1—3质量份、ATP 0.1—0.5质量份、乳糖1—3质量份、青霉素0.05—0.08质量份、链霉素0.1—0.4质量份，还可以添加脱脂奶粉0.5—1质量份。本发明的技术方案原材料来源方便，配置方法简单，能够明显提高猪精液常温保存的效果，延长猪精子常温保存有效存活时间和总存活时间。
CN 110393183 ACN 110393183 A
权 利 要 求 书
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1.稀释剂，其特征在于，由Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、青霉素、链霉素和水组成，每100ml水中，Tris 3—5质量份、柠檬酸1—3质量份、ATP 0.1—0.5质量份、乳糖1—3质量份、青霉素0.05—0.08质量份、链霉素0.1—0.4质量份。
2.根据权利要求1所述的稀释剂，其特征在于，每100ml水中，Tris 3—3.5质量份、柠檬酸1—2质量份、ATP 0.3—0.5质量份、乳糖1.5—2.5质量份、青霉素0.05—0.06质量份、链霉素0.1—0.3质量份。
3.如权利要求1—2之一所述的稀释剂的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：按照稀释剂的组成，向水中依次添加Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、青霉素、链霉素，并混合均匀即可。
4.稀释剂，其特征在于，由Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、脱脂奶粉、青霉素、链霉素和水组成，每100ml水中，Tris 3—5质量份、柠檬酸1—3质量份、ATP 0.1—0.5质量份、乳糖1—3质量份、脱脂奶粉0.5—2质量份、青霉素0.05—0.08质量份、链霉素0.1—0.4质量份。
5.根据权利要求4所述的稀释剂，其特征在于，每100ml水中，Tris 3—3.5质量份、柠檬酸1—2质量份、ATP 0.3—0.5质量份、乳糖1.5—2.5质量份、脱脂奶粉0.5—1质量份、青霉素0.05—0.06质量份、链霉素0.1—0.3质量份。
6.如权利要求4或者5所述的稀释剂的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：按照稀释剂的组成，向水中依次添加Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、脱脂奶粉、青霉素、链霉素，并混合均匀即可。
7.根据权利要求1、2、4或者5之一所述的稀释剂，其特征在于，每1质量份为1g；链霉素为硫酸链霉素；青霉素为青霉素钠；水为超纯水、蒸馏水、纯净水、二蒸水或者三蒸水；Tris为分析纯，柠檬酸为分析纯，ATP为医药级，乳糖为分析纯，链霉素为兽用注射硫酸链霉素，青霉素为兽用注射青霉素钠，脱脂奶粉为食品级，产品标准为Q/WDS0011S。
8.如权利要求1、2、4或者5之一所述的稀释剂在猪精液常温保存中的应用，其特征在于，猪鲜精和稀释剂的体积比为1：(1—5)，优选1：(2—4)；将稀释剂和猪鲜精一起置于常温中进行保存，以使两者达到相同温度，再进行混合，常温为17℃±0.5℃。
9.根据权利要求8所述的稀释剂在猪精液常温保存中的应用，其特征在于，乳糖添加可使有效存活时间达到平均14.43±0.52天，总存活时间平均可达24.13±0.54天；乳糖和脱脂奶粉的协同作用，可使有效存活时间达到平均17.53±0.10天，总存活时间平均可达24.79±0.68天。
10.乳糖和脱脂奶粉在猪精液常温保存中的应用，其特征在于，乳糖添加可使有效存活时间达到平均14.43±0.52天，总存活时间平均可达24.13±0.54天；乳糖和脱脂奶粉的协同作用，可使有效存活时间达到平均17.53±0.10天，总存活时间平均可达24.79±0.68天。
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CN 110393183 A
说 明 书
稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用
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技术领域
[0001]本发明涉及猪的人工授精，更加具体地说，涉及一种稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用。
背景技术
[0002]猪人工授精技术是最简单有效的种猪培育和商品猪生产的方法，是实现科学现代化养猪的重要手段。与自然本交相比，猪人工授精有许多优点，它可以提高良种种公猪的利用率，能促进养猪业的品种改良和商品猪的质量；可以克服体格大小差异过大造成的交配困难；能减少疾病的传播；能减少人力、财力和物力的投入，提高养猪业的经济效益；在一定程度上可以克服精液地域和时间的限制，便于大面积推广应用。[0003]猪人工授精技术的核心技术之一是猪精液的保存。好的精液保存(有效存活时间长)方法不仅能够大大促进猪人工授精技术的推广，而且对人工授精技术推广产生的价值至关重要。猪精液保存有常温保存、低温保存和冷冻保存三种方法。三种方法各有优缺点。常温保存方法简单，是目前养猪业生产上普遍应用的方法，缺点是保存时间较短。低温保存和冷冻保存目前技术上都还不很成熟，保存效果都不理想，要么有效保存时间短，要么保存后活率低，目前在生产实践中应用较少，特别是低温保存精液。由于猪精液的冷冻保存所需设备投资较高，冷冻保存技术难度大，冻精的受精率和受胎率下降明显；由于猪精液的低温保存不如常温保存效果好；也由于常温保存具有设备简单，操作方便，保存效果好等优点，因此常温保存是最常用的精液保存方法，目前广泛应用于国内外的生猪生产和种猪扩繁的实践中，为我国畜牧业的发展和肉类产品的供应作出了重要的贡献。常温保存是指将猪精液放置在15℃～25℃环境下的保存方法，通常是将猪精液放置在17℃的恒温箱内进行保存，首先要对取自正规猪场的猪新鲜精液进行品质评定，只有评定合格的猪精液才能用于保存，评定标准一般为精子活率在0.7以上，精子畸形率在0.2以下。将合格的新鲜猪精液分装到离心管中，用离心机进行离心处理，去除精浆，然后加入等温的猪精液常温保存稀释液，混合均匀后，将封口后的离心管放在17℃的恒温箱中保存即可。因此，如何进一步提升常温保存条件下猪精液的受精和受胎能力，改良优化猪精液常温保存的关键技术---猪精液常温保存稀释液，仍是业界的一个重大课题，也是近些年来人们孜孜不倦一直研究的领域。
发明内容
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用。本发明原材料来源方便，配置方法简单，能够明显延长猪精子常温保存的有效存活时间和总存活时间。
[0005]本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：[0006]稀释剂，由Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、青霉素、链霉素和水组成，每100ml水中，Tris 3—5质量份、柠檬酸1—3质量份、ATP 0.1—0.5质量份、乳糖1—3质量份、青霉素0.05—
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CN 110393183 A
说 明 书
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0.08质量份、链霉素0.1—0.4质量份。[0007]优选的，每100ml水中，Tris 3—3.5质量份、柠檬酸1—2质量份、ATP 0.3—0.5质量份、乳糖1.5—2.5质量份、青霉素0.05—0.06质量份、链霉素0.1—0.3质量份。[0008]在进行制备时，按照下述步骤进行：按照稀释剂的组成，向水中依次添加Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、青霉素、链霉素，并混合均匀即可。[0009]上述稀释剂在猪精液常温保存中的应用，猪鲜精(即采集后的猪精液)和稀释剂的体积比为1：(1—5)，优选1：(2—4)。[0010]稀释剂，由Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、脱脂奶粉、青霉素、链霉素和水组成，每100ml水中，Tris 3—5质量份、柠檬酸1—3质量份、ATP 0.1—0.5质量份、乳糖1—3质量份、脱脂奶粉0.5—2质量份、青霉素0.05—0.08质量份、链霉素0.1—0.4质量份。[0011]优选的，每100ml水中，Tris 3—3.5质量份、柠檬酸1—2质量份、ATP 0.3—0.5质量份、乳糖1.5—2.5质量份、脱脂奶粉0.5—1质量份、青霉素0.05—0.06质量份、链霉素0.1—0.3质量份。
[0012]在进行制备时，按照下述步骤进行：按照稀释剂的组成，向水中依次添加Tris、柠檬酸、ATP、乳糖、脱脂奶粉、青霉素、链霉素，并混合均匀即可。[0013]上述稀释剂在猪精液常温保存中的应用，猪鲜精和稀释剂的体积比为1：(1—5)，优选1：(2—4)。
[0014]在上述技术方案中，每1质量份为1g。[0015]在上述技术方案中，链霉素为硫酸链霉素。[0016]在上述技术方案中，青霉素为青霉素钠。[0017]在上述技术方案中，水为超纯水、蒸馏水、纯净水、二蒸水或者三蒸水。[0018]在上述技术方案中，Tris为分析纯，柠檬酸为分析纯，ATP为医药级，乳糖为分析纯，链霉素为兽用注射硫酸链霉素，青霉素为兽用注射青霉素钠，脱脂奶粉为食品级，产品标准为Q/WDS 0011S。
[0019]将制备的稀释剂进行冰箱冷藏室(0—5℃)保存，保存时间不超过一周(即7天，每天24小时)。最好现配现用。在进行使用时，将稀释剂和猪精液(鲜精)一起置于常温(17℃±0.5℃)中进行保存，以使两者达到相同温度，再进行混合。
[0020]本发明还提供了乳糖和脱脂奶粉在猪精液常温保存中的应用。[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本猪精液常温保存稀释液具有原材料来源方便、配置方法简单的优点，能够明显提高猪精液常温保存的效果，使猪精子常温保存(17℃±0.5℃)的有效存活时间平均延长到14天以上，总存活时间平均延长至24天以上(每天24小时)。
附图说明
[0022]图1是本发明实施例中基础稀释剂和添加脱脂奶粉的稀释剂对猪精液常温保存效果的测试柱形图，其中1表示为有效存活时间，2为总存活时间。
[0023]图2是本发明实施例中乳糖添加量对猪精液常温保存效果的测试柱形图，其中1为有效存活时间，2为总存活时间。
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说 明 书
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具体实施方式
[0024]下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细阐述。[0025]使用的主要仪器设备和试剂如下：[0026]海尔冰箱：型号BCD-216SDN，青岛海尔电冰箱股份有限公司。[0027]生物培养箱：型号MX-260B，上海福玛实验设备有限公司制造。[0028]离心机：型号TGL-16B，上海安亭科学仪器厂。[0029]电子天平：型号JB2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司制造。[0030]普通生物显微镜：型号BA410，Motic公司产品。[0031]超纯水器：型号UPT-II-10T，四川优普超纯水科技有限公司。[0032]Tris(三羟甲基氨基甲烷)：分析纯，北京格林博远生物科技有限公司，货号ZZ02531，Novon公司进口分装产品。[0033]柠檬酸：分析纯，批号2015920，天津市北辰方正试剂厂生产。[0034]ATP：医药级，批号120612，江苏康宝制药有限公司产品。[0035]乳糖：分析纯，批号130511，天津市北方天医化学试剂厂生产。[0036]注射用青霉素钠(青霉素)：兽用，批号A120201116，哈药集团制药总厂产品。[0037]注射用硫酸链霉素(链霉素)：兽用，批号1369130111，河北远征药业有限公司产品。
[0038]脱脂奶粉：食品级，黑龙江省完达山乳业股份有限公司生产，产品标准号：Q/WDS 0011S，生产日期：2016-05-07。[0039]利用上述原料进行稀释剂的配制如下：[0040](1)基础液1：100ml超纯水，Tris 3g，柠檬酸1.3g，ATP 0.3g，乳糖2.375g，青霉素0.06g，链霉素0.1g；[0041](2)基础液2：100ml超纯水，Tris 3g，柠檬酸1.3g，ATP 0.3g，乳糖1.25g，青霉素0.06g，链霉素0.1g；[0042](3)在基础液1的基础之上，分别按照5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的浓度添加脱脂奶粉，脱脂奶粉的加入量分别为0.5g、1g和2g。[0043]猪鲜精为长白猪精液，活率0.85以上，来自天津市警备区青光农场种猪场。种公猪健康，强壮，生殖能力正常。鲜精用毛巾包裹，1～2h内运回实验室。运输过程中应避光，应防止精液的温度快速下降和剧烈震荡。取回实验室的猪鲜精应与稀释剂同时放置于17℃(±0.5℃)恒温箱内同一部位，两小时后，使新鲜精液和稀释剂的温度都为17℃，从而达到温度的平衡。
[0044]取2mL的新鲜猪精液于塑料指管，置离心机中2000rpm离心2min，弃上清液，缓慢地向塑料指管中加入6mL等温的常温保存稀释液。稀释精液时一定将稀释液向精液里加，要沿着塑料指管的管壁缓慢地加入，且边加边轻轻混匀，防止对精子造成稀释打击。另外，稀释倍数大时，应尽量分次进行稀释。稀释好的精液用脱脂药棉密闭封口，并贴上标签，做好标记，然后放入已经设置为17℃(±0.5℃)的恒温箱中保存，直至所有精子死亡。在保存期间，每隔24小时应将保存精液混匀一次。混匀时，应先将塑料指管的上端对折，防止精液流入药棉内，再轻轻颠倒精液来混匀精液。在保存期间，最好还要隔绝空气且避光。
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说 明 书
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新鲜精液和稀释精液要检查精子活率，保存精液则从保存的第十天起，每隔24小
时用光学显微镜检查一次精子的活率，并做好记录，直至所有精子死亡。检查时，用移液枪吸取10μL待测精液滴加在温度大约为37℃的洁净载玻片上，从一侧轻轻的盖上盖玻片，置光学显微镜下进行观察。计算精子活率的方法通常是避开盖玻片的边缘部位，选择3个不同的视野，最好呈正三角形，每个视野大概10个精子，然后计算出存活的精子数和精子存活率。试验数据用SPSS17.0统计软件进行了统计分析，并进行了差异的显著性检验。[0046]添加于基础液1中的脱脂奶粉对常温保存猪精子存活时间的影响，如下表所示(单位：天)，表中上标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，上标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，后同。
[0047]
脱脂奶粉添加量有效存活时间总存活时间0mg/mL14.43±0.52A24.13±0.54Aa5mg/mL16.51±0.50B25.82±0.19B10mg/mL17.53±0.10C24.79±0.68Aa20mg/mL11.15±1.12D22.11±0.63C[0048]与对照组相比，5mg/mL和10mg/mL脱脂奶粉组能极显著延长常温保存猪精子的有效存活时间(P＜0.01)；而20mg/mL脱脂奶粉组则会明显缩短猪精子的有效存活时间(P＜0.01)。三组脱脂奶粉组比较，有效存活时间10mg/mL脱脂奶粉组＞5mg/mL脱脂奶粉组＞20mg/mL脱脂奶粉组，10mg/mL脱脂奶粉组和5mg/mL脱脂奶粉组的有效存活时间极显著长于20mg/mL脱脂奶粉组(P＜0.01)。从总存活时间來看，除5mg/mL脱脂奶粉组较对照组能极显著提高外(P＜0.01)，其它二脱脂奶粉组则并没有提高(10mg/mL脱脂奶粉组，P>0.05)甚至出现明显减少(20mg/mL脱脂奶粉组，P<0.01)。[0049]随保存天数的增加，5mg/mL(0.5％)和10mg/mL(1.0％)脱脂奶粉组猪精子活率的变化情况详见下表。
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[0051][0052]
再看乳糖添加量对常温保存猪精子存活时间的影响，如下表所示(单位：天)
乳糖添加量有效存活时间总存活时间
23.75mg/mL14.43±0.52a24.13±0.54a12.50mg/mL13.38±0.56b23.01±0.63b
[0053]乳糖添加量为23.75mg/mL时猪精子的有效存活时间为14.43±0.52天，而乳糖添加量为12.50mg/mL时猪精子的有效存活时间为13.38±0.56天，两者差异显著(P＜0.05)。从总存活时间来看，23.75mg/mL乳糖组和12.50mg/mL乳糖组的总存活时间分别为24.13±0.54天和23.01±0.63天，两者差异也显著(P＜0.05)。[0054]随保存天数的增加，12.50mg/mL(1.25％)和23.75mg/mL(2.375％)乳糖组猪精子活率的变化情况详见下表。
[0055]
保存天数1011121314151612.50mg/mL乳糖0.59±0.050.56±0.040.53±0.060.50±0.040.46±0.040.42±0.030.39±0.0523.75mg/mL乳糖0.64±0.060.62±0.050.59±0.040.58±0.050.53±0.060.50±0.030.46±0.03
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CN 110393183 A
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0.35±0.040.43±0.040.32±0.030.38±0.040.28±0.030.34±0.050.21±0.040.28±0.030.18±0.030.23±0.030.10±0.020.15±0.030.00±0.000.05±0.02 0.00±0.00
[0056]由此可知，稀释液中添加5-10mg/mL脱脂奶粉，能明显延长猪精子的有效存活时间，但当添加量达到20mg/mL时，反倒会缩短猪精子的有效存活时间和总存活时间。猪精液常温保存稀释液中的乳糖添加量由12.5mg/mL增加到23.75mg/mL时，猪精子的有效存活时间和总存活时间均显著增加(P<0.05)，分别由13.38±0.56天增加到14.43±0.52天，由23.01±0.63天增加到24.13±0.54天。
[0057]根据本发明内容进行配方的调整，均可实现稀释剂的制备，且与实施例表现出基本一致的性能，即延长猪精液常温(17℃±0.5℃)的保存时间，乳糖添加可使有效存活时间达到平均14.43±0.52天，总存活时间平均可达24.13±0.54天；乳糖和脱脂奶粉的协同作用，可使有效存活时间达到平均17.53±0.10天，总存活时间平均可达24.79±0.68天。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
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说 明 书 附 图
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