细胞的总蛋白质提取全过程及经验

细胞的总蛋白质提取全过程及经验

如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项： 师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般 我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷 的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。 一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后 一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的 能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次， 间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。 裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上 面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:0.1， 体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。 细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h， 然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。 Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的 时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将 蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，1.5mL 的EP tube 也可以使用。之 所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般 要求在5-6mg/mL 之间，所以buffer 的体积也会比较的大。 这里蛋白在离心的时候，是片状的，一定要慢慢转移，防止损失，不行就多次转移，每 次都将离心管离心去上清。 转移后的蛋白离心除去酒精，这时候还是会有部分水分的，就在冻干机里面冻干，尽量 在室温下操作。冻干后的蛋白质就可以保存起来了。 然后在使用之前，测定蛋白质的浓度，如果你用了8M 尿素溶解，在酶解的

时候，就需 要稀释到<2M，所以蛋白初始浓度不能太低。在蛋白复溶的时候，尽量在4 度操作，然后一 定要慢慢的加buffer，加多了就不好了，只要蛋白能完全溶解就好。完全溶解的蛋白，会有 些粘稠，但是绝对不会有不溶物产生，如果产生了不溶物，就说明需要加buffer，一般复溶 这一步要进行一个下午最少！