大麦籽粒β-葡聚糖含量的全基因组关联分析

大麦籽粒β-葡聚糖含量的全基因组关联分析

耿 腊1 黄业昌2 李梦迪1 谢尚耿1 叶玲珍1,3,* 张国平1

1

2 3 浙江大学作物科学研究所, 浙江杭州 310058; 温州科技职业学院, 浙江温州 325000; 浙江大学新农村发展研究院, 浙江杭州 310058

摘 要: β-葡聚糖是大麦籽粒的一个重要品质性状, 其含量高低影响大麦啤用、饲用和食用品质。虽然有关大麦β-葡聚糖合成的相关基因已有报道, 但关于大麦籽粒β-葡聚糖积累的遗传调控机制仍不十分清楚。本研究以前期收集的全球119份大麦基因型为材料, 种植在土壤与气候条件有一定差异的两试点, 利用混合线性模型(MLM)和一般线性模型(GLM)对不同大麦材料籽粒β-葡聚糖含量进行GWAS分析。结果表明, 大麦籽粒β-葡聚糖含量的基因型差异显著, 其在2个环境下的广义遗传力为73.9%。利用MLM和GLM模型分别检测到8个和40个显著位点, 合并2个模型重叠位点后共得到44个显著位点, 其中HORVU5Hr1G022710基因在2个模型、2个地点均被鉴定到, 故被认为是与β-葡聚糖含量显著相关的候选基因。2个模型中最佳等位基因数与β-葡聚糖含量均呈显著正相关。此外, 基于基因注释, 共鉴定到10个与糖合成、转运及分解相关的酶类基因, 这些基因可能与籽粒中β-葡聚糖的合成、积累和分解紧密相关。本研究结果为阐明β-葡聚糖的遗传调控机制提供了新的视角, 亦为大麦籽粒β-葡聚糖的遗传改良奠定了一定的理论基础。

关键词: 大麦; β-葡聚糖; 全基因组关联分析; SNP位点; 最佳等位基因

Genome-wide association study of β-glucan content in barley grains

GENG La1, HUANG Ye-Chang2, LI Meng-Di1, XIE Shang-Geng1, YE Ling-Zhen1,3,*, and ZHANG Guo-Ping1

1

Institute of Crop Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China; 2 Wenzhou Vocational College of Science and Technology,

Wenzhou 325000, Zhejiang, China; 3 New Rural Development Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

Abstract: β-glucan is an important trait in barley, as its content greatly affects the quality in the applications of malting, feeding, and food. Although the genes associated with β-glucan synthesis have been reported, genetic regulation of β-glucan accumulation in barley grains is still unclear. In this study, genome-wide association study (GWAS) with mixed linear model (MLM) and gen-eral linear model (GLM) was performed to analyze the grain β-glucan content of 119 barley germplasms collected from world-wide previously, which were planted at two plots with certain differences in soil and climate conditions. The results showed β-glucan content in barley grains was significantly different in genotypes and the heritability of β-glucan was 73.9% in two envi-ronments. There were eight and 40 loci for grain β-glucan content detected by MLM and GLM, respectively. A total of 44 loci were obtained by combining the same loci of the two models. HORVU5Hr1G022710 gene identified in both models and sites was considered as a putative candidate gene significantly associated with β-glucan content. Significantly positive correlation was de-tected between grain β-glucan content and the number of favorable alleles in both models. In addition, 10 enzymatic genes related to sugar synthesis, transport and decomposition were identified based on gene annotations. These genes may significantly relate to β-glucan synthesis, accumulation and hydrolysis. The results provided a new insight into the genetic regulation of β-glucan accu-mulation and laid a foundation for the genetic improvement breeding of barley seed β-glucan.

Keywords: barley; β-glucan; genome-wide association study (GWAS); SNP loci; favorable allele

本研究由浙江省自然科学基金项目(LGN20C130007), 国家自然科学基金项目(31701411)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-05)资助。

This study was supported by the Science and Technology Program of Zhejiang Province (LGN20C130007), the National Natural Science Foundation of China (31701411), and the China Agriculture Research System (CARS-05).

*

通信作者(Corresponding author): 叶玲珍, E-mail: Yelingzhen@zju.edu.cn

第一作者联系方式: E-mail: 21816022@zju.edu.cn

Received (收稿日期): 2020-08-23; Accepted (接受日期): 2020-12-01; Published online (网络出版日期): 2020-12-30. URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201230.1429.002.html

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作 物 学 报 第47卷

大麦是全球广泛栽培的主要谷类作物, 且用途多样, 集饲用、啤用和食用于一体。与水稻、玉米和小麦等其他禾谷类作物相比, 大麦籽粒的化学成分独特, 其中富含β-葡聚糖是其主要特点之一, 平均含量高于小麦近10倍[1]。β-葡聚糖是大麦籽粒胚乳和糊粉层细胞壁的主要成份, 无论在啤用、饲用还是食用上都是一个重要的品质性状。用于酿造啤酒时, 大麦籽粒β-葡聚糖会增加麦汁黏度从而影响麦汁的过滤速度, 降低麦芽浸出物产量, 同时还因产生凝胶沉淀作用而使啤酒易发生混浊[2]; 用于饲料原料时, β-葡聚糖会增加非反刍畜禽动物肠液的黏度, 影响食料的消化和吸收, 从而降低饲用价值, 故被认为是畜禽的一种抗营养因子[3-4]。相反, 大麦用于人类食粮时, β-葡聚糖则是一种有益健康因子, 它具有降低血液胆固醇及预防结肠癌、直肠癌的作用[5]。因此, 明确大麦籽粒β-葡聚糖合成的遗传及其调控基因, 筛选与鉴定相关分子标记, 根据大麦用途调控β-葡聚糖的合成与积累, 对于提高专用大麦品种的品质具有重要意义。

首个发现与大麦β-葡聚糖合成相关的基因是纤维素合成酶类基因(CesA)[6]。后续研究显示, 大麦β-葡聚糖由纤维素合成酶类F (CslF)和纤维素合成酶类H (CslH)基因家族成员共同调控合成[7-8]。CslF基因家族是纤维素合成酶基因超家族的一部分, 由位于大麦基因组1H、2H、5H和7H染色体上的10个成员组成[8-9]; 其中CslF6基因在决定β-葡聚糖含量中发挥着重要作用。大麦过表达由胚乳特异性启动子控制的CslF6基因可显著增加籽粒β-葡聚糖含量[10], 而小麦中下调该基因表达可显著降低籽粒β-葡聚糖含量[11]。虽然大麦β-葡聚糖合成相关的基因已有报道, 但有关大麦籽粒β-葡聚糖积累的遗传调控机制仍不十分清楚。

近年来, 全基因组关联研究(genome-wide asso-ciation study, GWAS)分析作为重要的遗传解析方法, 已广泛应用于水稻、玉米和小麦等作物重要农艺性状的基因鉴定研究[12-14]。在大麦中, 利用这一方法已对籽粒密度[15]、花期[16]、棱型[17]等重要性状进行过相关研究, 但对籽粒β-葡聚糖等重要品质性状仍有待于开展更深入和广泛的研究。本研究拟以119份大麦种质资源(包括西藏半野生大麦、国内栽培品种及国际常见商业品种)为材料, 分别种植在土壤和气候条件存在一定差异的2个试点, 对籽粒β-葡聚糖含量进行GWAS分析; 旨在获得与β-葡聚糖含量显著

连锁的SNP位点, 挖掘其优异等位变异及预测候选基因, 从而为大麦β-葡聚糖的遗传改良提供理论指导与优异基因资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料与田间试验

本研究供试大麦材料共119份, 含我国西藏半野生大麦44份、我国栽培品种59份、国外栽培品种16份。所有材料均于2018年11月初播于浙江大学长兴农业科学试验站(CHX)和浙江省慈溪农业科学试验站(CX)。长兴和慈溪的土壤pH分别为6.0和8.29, 全氮含量分别为1.22 g kg‒1和1.31 g kg‒1, 速效磷含量分别为8.9 mg kg‒1和102 mg kg‒1, 速效钾含量分别为12.5 mg kg‒1和163 mg kg‒1。每份材料种5行, 每行播50粒种子, 行长2 m, 行间距0.25 m。所有农艺管理措施, 包括施肥、除草和病虫害防治等与当地大田生产相同。大麦成熟时每份材料收中间3行的种子, 干燥后储存于4℃冰箱备用。

1.2 β-葡聚糖含量测定

大麦种子用旋风磨粉机粉碎, 过40目筛, 密闭储存。β-葡聚糖按Houston等[18]介绍的方法, 采用Megazyme公司生产的β-葡聚糖试剂盒(K-BGLU 02/17)测定, 每份材料测定重复3次。

1.3 DNA提取和基因型分析

供试大麦材料培养至二叶一心, 取叶片, 采用CTAB法提取全基因组DNA; 用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量及浓度。委托澳大利亚Dart公司(https://www.diversityarrays.com/)进行全基因组SNP标记分型。获得的基因型数据按完整度大于等于0.8, 最小等位基因频率占有分型样本比例(Minor Allele Frequency, MAF)大于0.05筛选, 共获得7287个高质量的SNP位点, 用于后续群体结构、亲缘关系以及全基因组关联分析。

1.4 全基因组关联分析、候选基因鉴定与基因表达分析

用Structure 2.3.3软件进行群体结构Q矩阵的计算, 用SPAGeDi计算亲缘关系K矩阵。将基因型、表型、Q矩阵和K矩阵导入Tassel 5.0后, 以Q矩阵和Q+K矩阵作为协变量, 分别进行基于一般线性模型(General Linear Model, GLM)和混合线性模型(Mixed Linear Model, MLM)的全基因组关联分析。在关联分析过程中计算获得每个SNP位点的P值和R2。将显著性阈值设置为P≤110–4和P≤110–3, 即

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耿腊等: 大麦籽粒β-葡聚糖含量的全基因组关联分析 1207 –log10(P)≥和–log10(P)≥3, 使用R软件将GWAS分析结果绘制成曼哈顿图和QQ图。

利用大麦全基因组数据库, 对GWAS分析所获的显著性标记附近提取±100 kb范围内基因作为候选基因; 进一步在数据库中提取注释信息和基因表达谱信息。

2 结果与分析

2.1 β-葡聚糖含量的基因型与环境差异

供试的119份大麦材料的β-葡聚糖含量在2个环境中存在显著的差异, 长兴和慈溪点β-葡聚糖含量分别变动于1.66%~5.48%和1.98%~6.49%, 平均含量分别是3.03%和3.39% (图1)。所有材料在2个环境种植, β-葡聚糖含量的相关系数为0.75 (P≤0.001), 达极显著水平, 且呈正态分布。方差分析表明, 基因型、环境、互作和误差可分别解释表型变异的76.46%、8.18%、12.40%和2.96% (表1), 且β-葡聚糖含量在2个环境下的广义遗传力为73.9%, 说明大麦籽粒β-葡聚糖含量主要受遗传控制。

1.5 数据分析

采用SPSS软件进行频次分布图制作、相关和方差分析。使用的模型为混合线性模型: y = μ+基因型+环境+基因型×环境+误差(基因型和环境为固定因子); 遗传力按H2 = Vg/[Vg+VGL/L+Ve/(L×R)]估算, 其中Vg表示品种方差, VGL表示地点和品种的互作, Ve表示残差的方差组分, L为2 (2个地点), R为3 (3次重复)。

图1 119份大麦材料在长兴(A)和慈溪(B)的β-葡聚糖含量分布以及2个地点的β-葡聚糖含量相关性(C)

Fig. 1 Distribution frequency of β-glucan content of the examined 119 barley accessions at CHX (A) and CX (B) and correlation between two different sites (C) **

表示在0.01水平差异显著。** Significant differences at P = 0.01.

表1 119份栽培品种在2个不同环境中的β-葡聚糖含量方差分析

Table 1 Variance analysis of β-glucan content from 119 barley cultivars in two environments

变异源 Source of variation 基因型 Genotype 环境 Environment

环境×基因型 Genotype × Environment 误差 Residual error 总计 Total

***

III型平方和 SS

235.00 25.13 38.12 9.10 307.35

自由度 DF 118 1 118 476 713

均方 MS 1.98 25.13 0.32 0.02

F值 F-value

R2 (%)

104.14*** 76.46 1325.35*** 8.18 16.90*** 12.40

2.96

表示在0.001水平差异显著。

***

Significant differences at P = 0.001.

2.2 β-葡聚糖含量的全基因组关联分析

利用MLM模型对2个环境下的β-葡聚糖含量进行全基因组关联分析, 当阈值为log10(P)≥3时, 在长兴和慈溪2个环境型中分别检测到7个和2个显著位点(图2和表2), 其中位于5号染色体的标记M-3924095 (标记编号4)在2个环境中均被检测到。合并重叠的位点后得到8个显著性位点, 分布在2号~7号染色体, 可解释13.5%~16.98%的表型变异。

同时, 利用GLM模型对2个环境下的β-葡聚糖

含量进行全基因组关联分析, 当阈值为log10(P)≥4时, 在长兴和慈溪分别检测到32个和17个显著位点(图3和表3), 其中有9个位点在2个环境中均被检测到。合并重叠的位点后得到40个显著性位点, 分布在各条染色体, 可解释12.24%~22.93%的表型变异。

比较以上2个关联模型的结果, MLM模型和GLM模型有4个位点重叠, 分别是M-3262394、M-3924095、M-3263056和M-3911599; 合并2个模型的结果, 共得到了44个显著位点。

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图2 MLM模型下β-葡聚糖含量的曼哈顿图

Fig. 2 Manhattan plot of grain β-glucan content in MLM model

A: 长兴β-葡聚糖含量MLM曼哈顿图; B: 慈溪β-葡聚糖含量MLM曼哈顿图。水平线代表显著相关的1E-03阈值。

A: Manhattan plot of MLM in CHX; B: Manhattan plot of MLM in CX. The horizontal line depicts the 1E-03 threshold for significant asso-ciation.

表2 MLM模型下β-葡聚糖含量显著相关的SNP位点(log10(P) > 3)

Table 2 SNP markers significantly associated with β-glucan content in MLM model 标记编号 MTA No.

标记名称 染色体 Marker

Chr.

位置 Position

峰值 log10(P)

表型贡献率R2 (%)

环境 Environment

最佳等位基因a SNP

a

最小等位基因频率 MAF

候选基因 Putative candidated

genes

HORVU2Hr1G122540,HORVU2Hr1G122560, HORVU2Hr1G122570,HORVU2Hr1G122580

1 M-4172115 2 753357365 3.50 16.98 CHX HORVU2Hr1G122510, A/G 0.14 2 M-3262394 3 640508648 3.16 13.50 CX 3 M-3432496 4 629360418 3.07 13.55 CHX 4 M-3924095 5 116486105 3.28 14.20

3.22

14.40

CX CHX

A/G 0.12 HORVU3Hr1G092890HORVU4Hr1G084590C/T 0.14

A/G 0.07 HORVU5Hr1G022710HORVU6Hr1G022070, G/T 0.05 HORVU6Hr1G022080

HORVU6Hr1G055090C/G 0.11 A/C 0.05 HORVU7Hr1G038040,

HORVU7Hr1G038060,HORVU7Hr1G038070, HORVU7Hr1G038080

5 M-3263056 6 68979147 3.88 13.65 CHX 6 M-4792001 6 350443314 3.19 15.62 CHX 7 M-3911599 7 93157425 3.29 14.13 CHX

8 M-3665085 7 199549260 3.44 14.79 CHX

aa

HORVU7Hr1G052390, A/G 0.17

HORVU7Hr1G052400

下画线表示提高β-葡聚糖含量最佳等位基因。

Favorable alleles for increasing β-glucan content are underlined. MAF: minor allele frequency.

2.3 最佳等位基因对β-葡聚糖含量的影响

为了明确检测到的显著性位点在大麦育种上利用价值, 在此我们引入最佳等位基因。对119份大麦籽粒β-葡聚糖含量和等位基因信息进行方差分析, 可显著提高β-葡聚糖含量的等位基因视为最佳等位基因(表2和表3)。在MLM模型和GLM模型中, 最佳等位基因的数量分别为0~7和3~30 (附表1), 且与β-葡聚糖含量呈显著正相关(图4)。

117个基因, 合并重合基因, 2个模型共鉴定到126个基因(表2和表3)。HORVU5Hr1G022710基因在2个模型、2个地点均被鉴定到, 可认为是和β-葡聚糖含量显著相关的候选基因。该基因的注释信息为MYB21转录因子。此外, 基于基因注释, 共鉴定到10个与糖合成、转运及分解相关的酶类基因, 这些基因可能与籽粒中β-葡聚糖的合成、积累和分解紧密相关。结合基因转录表达信息, 发现这些候选基因在大麦不同组织和不同发育时期均有表达(图5和附表2); 在后续研究可通过转基因或者CRISPR/Cas9敲除, 进一步验证这些候选基因的功能。

2.4 候选基因鉴定

在显著性位点上下游100 kb范围内寻找候选基因, 基于MLM模型和GLM模型分别鉴定到17个和

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图3 GLM模型下β-葡聚糖含量的曼哈顿图

Fig. 3 Manhattan plot of grain β-glucan content in GLM model

A: 长兴β-葡聚糖含量GLM曼哈顿图; B: 慈溪β-葡聚糖含量GLM曼哈顿图。水平线代表显著相关的1E-04阈值。

A: Manhattan plot of GLM in CHX; B: Manhattan plot of GLM in CX. The horizontal line depicts the 1E-04 threshold for significant association.

图4 最佳等位基因个数和β-葡聚糖含量的线性回归分析

Fig. 4 Linear regression analysis of the number of favorable alleles and β-glucan content A: MLM模型结果; B: GLM模型结果。

A: MLM model results; B: GLM model results.

图5 11个候选基因转录本表达的热图和注释

Fig. 5 Heat map and annotations of transcript expression of 11 putative candidate genes

基因在各个生长发育期的转录表达值以对数进行标准化后的取值范围是–2.5~2.5, 红色表示高表达, 蓝色表示低表达, 灰色表示无表达。

For each period, the transcript expression values are calculated as LOG ranged from 2.5 to 2.5. Red blocks indicate high expression, blue indicate low expression, and gray mean no expression.

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3 讨论

本研究以119份大麦基因型为材料, 种植在土壤和气候条件存在明显差异的2个试点, 测定分析籽粒β-葡聚糖含量的基因型与环境差异。结果显示, 供试的大麦群体中β-葡聚糖含量的基因型差异显著, 其广义遗传力为73.9%, 证明β-葡聚糖含量主要受遗传控制, 环境条件虽有一定影响, 但作用相对较小[18]。因此, 根据大麦的用途, 通过遗传改良手段定向调控籽粒β-葡聚糖含量是现实可行的, 也是改善这一品质性状的有效途径。

本研究利用2个关联模型(MLM和GLM)鉴定调控籽粒β-葡聚糖含量的相关基因或位点, 共检测到44个显著位点, 分布于7条染色体上。在各个模型下, 两试点中均有位点重合, 且2个模型之间也有部分位点重合。这些在不同环境或模型下均检测到的位点, 可视为调控大麦籽粒β-葡聚糖含量的遗传位点。另外, 发现了可显著提高β-葡聚糖含量的等位基因, 即最佳等位基因。以上结果可为大麦分子标记辅助育种提供相关信息, 即最佳等位基因数较多的大麦品种, 如藏青320和Ticn, 适用于食用大麦育种; 相反, 那些最佳等位基因数较少的大麦品种, 如崇穗刺毛大麦和岗2, 则适用于饲用或者啤用大麦品种的育种。

国际上已有一些关于大麦籽粒β-葡聚糖含量的关联和连锁分析研究

[21-22]

, 结合前人研究结果, 发

现本研究中所发掘的位点大多数为新位点。已有大量文献显示纤维素合成酶类基因对大麦籽粒β-葡聚糖含量具有显著效应, 尤其是CslF6和CslH [7,10,23]。CslF6被认为是调控β-葡聚糖合成的主要基因, 但本研究中未鉴定到该基因。这可能是由于CslF6基因在β-葡聚糖合成中十分重要, 其编码区和启动子区的核苷酸高度保守[24]; 也有可能是其有效等位基因的比率过低(低于0.05, 被过滤)以及本研究的群体数目和SNP标记密度不够等原因引起。不过, 类似的大麦β-葡聚糖含量的遗传定位研究也有未鉴定到该基因的报道[18,25-27]。

因此, CslF6在大麦β-葡聚糖合成中的作用是否存在基因型依赖性, 值得深入研究。

虽然没有鉴定到已知与β-葡聚糖合成相关的基因, 但本研究鉴定到一些和糖代谢有关的酶类基因, 主要包括一些与糖转运和糖降解有关的酶, 它们可能与β-葡聚糖含量存在一定的关联。有研究表明, 水解酶和转运酶在决定最终β-葡聚糖含量具有重要作用

[28-30]

。在β-葡聚糖合成过程中, 转运酶负责催化糖

基化反应[28], 但是水解酶的具体作用尚不清楚, 仍需进一步研究。同时也有报道显示, 除纤维素合成酶类基因, 一些参与β-葡聚糖组装的酶类基因也可能对β-葡聚糖最终含量具有显著影响[31]。

本研究通过对大麦籽粒β-葡聚糖含量的GWAS分析, 其中大多数为新位点, 进一步挖掘到到一些与糖转运、降解相关的基因, 这与前人关注纤维素合成酶类基因的研究不同, 可为进一步研究β-葡聚糖的遗传调控提供了新的视角。

4 结论

本文采用GWAS方法, 分别用GLM和MLM两种模型开展了大麦籽粒β-葡聚糖含量有关的遗传调控机制解析及优良等位基因鉴定的系统研究, 共鉴定到44个重合位点, 126个候选基因。基于鉴定到的位点稳定性和基因功能注释, 共鉴定到11个可能与大麦籽粒β-葡聚糖合成、积累和分解紧密相关的酶类基因。该结果对于大麦品质性状形成和育种实践具有较好的理论和应用参考价值。

附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.china- crops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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