乙型肝炎表面抗原确认试验的临床应用探讨

现代医院２００８年２月第８卷第２期专业技术篇Ｍｏｄｅｍ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｆｅｂ　２００８　Ｖｏｌ　８　Ｎｏ　２　１３　乙型肝炎表面抗原确认试验的临床应用探讨　陈礼双杨培华黄伟　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＵＳＡＧＥ　ＯＦ　ＣＯＮＦＩＲＭＡＴＯＲＹ　ＴＥＳＴ　ＦＯＲ　ＨＢｓＡｇ　ＣＩＩＥＮ　Ｌｉｓｈｕａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｐｅｉｈｕａ，ＨＵＡＮＧ　Ｗｅｉ　【摘要】　目的利用国内研发的ＨＢｓＡｇ确认试齐】和确认方法对乙型肝炎表面抗原阳性标本进行确认　试验。方法ＨＢｓＡｇ确认试验方法Ｌ】　：以特异性抗一ＨＢｓ抗体中和样本中的ＨＢｓＡｇ并设立加对照液的对照　孔，然后按常规的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法检测样本中的ＨＢｓＡｇ含量（吸光度Ａ表示），按公式求得加　抗一ＨＢｓ孔的抑制率，如抑制率＞／５０％即表示该样本被确认为ＨＢｓＡｇ阳性。结果品的临床试用确认试剂进行测定，结果全部被确认。结论１００侧血清样本用研发产　本文用国内最新研究的确认方法和国内研发的确　认试剂对乙型肝炎表面抗原阳性样本进行的临床确认试验结果证实，获得了预期的效果，具有良好的特异性　和敏感度。在经过更多的临床病例确认试验和改进之后，该方法和试剂在临床中具有推广应用价值。　【关键词】　乙肝表面抗原　酶联免疫吸附试验（ＥｕｓＡ）　确认试验　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｅｔｕｐ　ａ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ＨＢｓＡｇ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ～ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｒｅａｇｅｎｔ　ｄｅ￣ｂｐｅｄ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．Ｍｅｔｈｏｄ　Ａｄｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉ—ＨＢｓ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｉｎｔｏ　ｓａｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｅｔｕｐ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ．Ａｆｔｅｒ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．ｄｅｔｅｃｔ　ＨＢｓＡｇ　ａｎｄ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｔｅｓｔ、　Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ａｓ　ＨＢｓＡｇ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｆ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｉｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　５０％．Ｒｅｓｕｌｔ　ＡＵ　ｏｆ　１００　ＨＢｓＡｇ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｘｌｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｉｒｆｍｅｄ　ａｓ　ＨＢｓＡｇ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｈ　ｐｒｏｖｅｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｏｎｉｒｆｍａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｈａｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｃｔ　ｐｕｒｐｏｓｅ．Ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｒｅ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｔｈｅｙ　ａｒｅ　ｗｏｒｔｈｙ　ｏｆ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｔｏ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ａｆｔｅｒ　ｍｕｃｈ　ｍｏｒｅ　ｔｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ＨＢｓＡｇ，ＥＬＩＳＡ，Ｃｏｎｆｉｍａｒｔｏｒｙ　Ｔｅｓｔ　【Ａｕｔｈｏｒ　Ｓ　ａｄｄｒｅｓｓ】Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　ＢｏＡｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖ—　ｉｎｃｅ，５１８００１　ＰＲＣ　一步法ＥＬＩＳＡ检测乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）多年来　其确认试剂也处于研究的后期临床试验阶段，并将很快应用　于临床诊断而填补国内乙肝表面抗原确认试剂缺如的空白。　本文１００例ＨＢｓＡｇ确认试验正是该确认方法和确认试剂的　临床实例应用，结果显示全部标本均得到确认。　１材料与方法　１．】血清样本　已有很多方面的技术改进，灵敏度高，特异性好，但由于血清　学反应中仍有诸多因素会干扰试验，重复性较差，出现非特　异性的假阳性。对一个低含量ＨＢｓＡｇ标本结果，手工操作　实验批内精密度（ｃＶ）可达１５％Ｌ２ｊ，实验批问的ｃＶ可高达　２５％～３０％＿３　，王岚等　用不同方法检测乙肝血清标志物，　以Ａｂｂｏｔｔ　Ａｘ—ｓｙｍ测定结果为标准，国产ＥＬＩＳＡ试剂测定　ＨＢｓＡｇ的特异性为９８．６９％，即有１．３１％的假阳性。处于　所用血清样本来自我院体检中心的健康成人体检人群，　用乙肝病毒表面抗原ＥＬＩＳＡ试剂测定，按说明书操作。取标　本如下：ＨＢｓＡｇ阳性血清标本１００例，其中可疑阳性标本２　例。　１．２试荆　Ｃｕｔｏｆｆ值附近的标本就会产生假阳性或假阴性的结果，这些　结果可能会影响一些人的就业、升学和参军等，还会引发医　患纠纷。为此在临床上推广乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）确　认试验，建立弱反应性标本确认程序，对于乙型肝炎等感染　性疾病的诊断和人群体检的正确性有重要意义　。　乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）ＥＬＩＳＡ阳性样本确认试验的方　法和试剂在国外早已建立，其检测试剂灵敏度高，而且对试　剂质量要求相当严格，因此几乎不存在假阴性和假阳性的困　扰。在国内，目前正处于确认试验方法的建立和研究阶段，　陈礼双：深圳博爱医院杨培华黄１．２．１　ＨＢｓＡｇ确认试剂　１．２．１．１特异性抗体试剂，系抗一ＨＢｓ含量约为２　０００　ＩＵ／Ｌ　的血清，加入０．０３％Ｐｒｏｃｌｉｎ防腐。　１．２．１．２　对照试剂，系含２０％小牛血清的磷酸缓冲液　（ＰＢＳ，０．Ｏ１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　７．２）加入０．０３％Ｐｒｏｃｌｉｎ防腐。　１．２．１．３阳性对照，ＨＢｓＡｇ阳性血清，约含５　ｎｇ／ｍｌ　ＰＢＳ的　ＨＢｓＡｇ。　广东深圳５１８００１　上海２０００８０　伟：上海海员医院１．２．２　ＨＢｓＡｇ诊断试剂盒（ＥＬＩＳＡ），批号２００６０１１５，有效期　维普资讯 http://www.cqvip.com

１４　现代医院２００８年２月第８卷第２期专业技术篇Ｍｏｄｅｍ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｆｅｂ　２００８　ｖｏｌ　８　Ｎｏ　２　２００７０１１５。　１．３确认试验　在ＨＢｓＡｇ诊断试剂盒的包被反应板上设置对照孔和检　测孔，分别加入不含抗一ＨＢｓ的对照试剂和含有抗一ＨＢｓ的　特异性抗体试剂与待确认样本进行反应。检测孔中的特异　性抗体与包被的固相抗一ＨＢｓ抗体竞争样本中的ＨＢｓＡｇ，从　而使结合到反应板上的ＨＢｓＡｇ含量减少；而对照孔中不存　在竞争，样本中的ＨＢｓＡｇ能正常地结合包被反应板上。随　后再与加入的酶标抗一ＨＢＳ反应，经过洗板加底物显色测得　值。如果待测样本中有ＨＢｓＡｇ存在，检测孔的Ａ值会明显　低于对照孔，则可确认样本中真正含有乙肝表面抗原；如果　检测孔的Ａ值下降不明显，表明样本中无ＨＢｓＡｇ存在。每　次试验设参考阳性和空白对照孔，与样本同步骤操作。　１．４确认试验的操作步骤　见表１。　表１确认试验的操作步骤（　）　设置　原对照　原检测１００倍对照１００倍检测　样本　５Ｏ　５Ｏ　　．５Ｏ　５Ｏ　对照试剂　５０　／　５０　／　特异性抗体试剂　／　５０　／　５０　３７℃温育３０　ｒａｉｎ　酶结合物　５Ｏ　５Ｏ　５Ｏ　５Ｏ　３７℃温育３０　ｒａｉｎ　洗板　底物混合液　１００　１００　１００　１００　３７℃温育１５　ｍｉｎ　终止液　５Ｏ　５Ｏ　５Ｏ　５Ｏ　最后４５０　ｎｍ读取吸光度（Ａ）值　注：结果计算：抑制率：（对照孔Ａ值一检测孔Ａ值）÷对照孔Ａ　值Ｘ　１００％。原对照为原倍样本对照孔，原检测为原倍样本检测孔，　１００倍对照为１００倍稀释样本对照孔，１００倍检测为１００倍稀释样本　检测孔　２结果　２．１阳性确认的判定　２．１．１参考阳性对照Ａ值必须大于０．５０，且抑制率必须＞　８０％，否则无效。　２．１．２若原倍样本或１００倍稀释样本的抑制率≥５０％，则　可确认ＨＢｓＡｇ阳性。　２．１．３若原倍样本的抑制率＜５０％，１００倍稀释样本的抑　制率＜５０％，且其对照孔Ａ值＜２．０，则可确认ＨＢｓＡｇ阴性。　２．１．４若１００倍稀释样本的抑制率＜５０％，而其对照孔Ａ　值≥２．０，则应对该样本进行更大倍数稀释（１０００倍、１００００　倍），再重复以上确认操作程序。　２．２抑制率阳性阈值　为抑制率ｔ＞５０％。　２．３血清标本测试结果　对２例ＨＢｓＡｇ阴性血清样本和１００例ＨＢｓＡｇ有反应性　血清样本进行原倍及１：１００倍稀释后进行确认试验，不能确　认的继续作１：１０００倍、１：１００００倍稀释直至获得结果。所得　结果见表２。　表２　ＨＢｓＡｇ阳性样本确认试验结果　０．３７－２．００　２５　２５（１００）８５．６　０（０）　２．０１—２．９５　７３　２７（３７．０）５３．９　１９（２６．０）　０．１６－０．１８　２　２（１００）８８．１　０（０）　注：表２中的抑制率对应的数字为最低抑制率　３分析与讨论　３，１　１００例ＨＢｓＡｇ阳性的血清样本中，原倍确认５４例占　５４％；１：１００稀释确认１９例占有１９％；没有被确认的２７例　占２７％，继续作１：１０００及１：１００００倍稀释，结果均得到确　认；总确认率达到１００％，抑制率大部分在８７％以上，最低　５３．９％。　３．２　２５例Ａ值在０．３７３～２，０００之间，１００％被确认为阳性，　抑制率最低８５．６％，大部分在９０％以上。说明选择抗一ＨＢｓ　的浓度为２０００　ＩＵ／Ｌ时，能够使Ａ镇＜２．０００的ＨＢｓＡｇ阳性　的样本均能被确认，与方筠等　报道一致。因此在实际工　作中可以只做原倍样本的确认试验，不进行样本的稀释，大　部分样本都能得到确认，降低成本减少工作量。　３．３　７３例Ａ值２．Ｏ１～２．９５之间，原倍及１：１００倍稀释确认　有４６例；没有被确认的２７例继续作１：１０００及１：１００００倍稀　释再按程序操作，结果均得到确认，且抑制率大部分在９３％　以上。Ａ值很高的样本需要更多的特异性抗体来中和抗原，　对标本作更大倍数的稀释，试剂成本提高，工作量加大。　３．４在１００例ＨＢｓＡｇ阳性的样本中，有２例可疑阳性样本　Ａ值分别为０．１６８和０．１７９，原倍确认试验为阳性。该两例　标本有抗一ＨＢｅ阳性、抗一ＨＢｃ阳性。对于ＨＢｓＡｇ临界结　果如何报告，各有差异，有的报了阴性，有的报了阳性，有的　报可疑阳性。笔者认为：①先不发报告待该份血清标本于次　日复查后再报告。②如果复查结果仍与前次相同可报告可　疑阳性，并与医生沟通，注明需要近期复查以观察其变化，是　否由于患者近期用药等内在因素所致；③也可与临床医生沟　通，报告测定结果Ｓ／ＣＯ的比值　ｊ，供临床医生参考。第四，　若能做确认试验则非常有必要。　３．５　临界结果　的报告，一直是困扰检验人员的一个问题，　临界范围是包含“灰区”　在内，且因方法的不精密度而产　生的更大的不确定的范围。除标本被测物含量较低外，其他　干扰因素有内源性的类风湿因子、补体、高浓度的非特异性　免疫球蛋白、嗜异性抗体、某些自身抗体等；外源性的有标本　溶血、标本被细菌污染、标本凝固不全、标本剧烈震荡、检测　过程中的操作误差等　。国外进口的ＨＢｓＡｇ检测系统或　试剂盒有阳性结果均需复检的要求，阳性结果需作双份复　检，结果的报告均为复检双孔阴性报阴性，复检双孔阳性报　阳性，复检双孔一阴一阳加做确认试验。目前在上海地区对　（采用夹心法的检验项目）临界范围的设定要求最小范围是　Ｃｕｔｏｆｆ值Ｘ０．７≤标本的测定值≤Ｃｕｔｏｆｆ值Ｘ　２。对一定数量　的弱反应性标本和接近于Ｃｕｔｏｆｆ值的阴性标本要进行复检。　３．６血清标本应注意使用新鲜样本最好，如暂时不能检测，　维普资讯 http://www.cqvip.com

现代医院２００８年２月第８卷第２期专业技术篇Ｍｏｄｅｍ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｆｅｂ　２００８　Ｖｏｌ　８　Ｎｏ　２　１５　心包穿刺置管引流术治疗大量心包积液的效果比较　莫文庆邓　虹王少军　ＥＶＡＬＵＡＴｌｌＯＮ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＵＳＥ　０Ｆ　ＰＥＲＩＣＡＲＤ１０ＰＵＮＣＴＵＲＥ　ＩＮＤＷＥＬＬＩＮＧ　ＣＡＴＨＥＴＥＲ　ＤＲＡＩＮＡＧＥ　ＴＲＥＡＴＩＮＧ　ＭＡＳＳ　ＰＥＲＥＩＣＡＲＤＩＡＬ　ＦＬＵＩＤ　ＭＯ　Ｗｅｎｑｉｎｇ，ＤＥＮＧ　ｌｔｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｓｈａｏｊｕｎ　【摘要】　目的评价心包穿刺置管引流术治疗大量心包积液的疗效和安全性。方法３６例大量心包　导管组与抽液组相比，并发症明显减少（Ｐ　积液病人随机分为两组，心包穿刺置管引流组（导管组）２０例，传统心包穿刺抽液组（抽液组）１６例，比较两组　并发症的发生率，心包积液引流量、积液吸收时间、住院日。结果＜０．０１），心包积液引流量明显增多，心包积液吸收时间、住院日均明显缩短（Ｐ＜０．０１）。结论心包穿刺置　管引流并发症少，症状改善快，可缩短住院日及减少住院费用，疗效和安全性优于传统穿刺抽液。　【关键词】　中心静脉导管心包积液　效、安全性，现报告如下。　１资料与方法　１．１临床资料　１９９９年１１月～２００７年１１月共行心包穿刺术３６例病　人。男１６例，女２０例，年龄１５～７５岁，平均４２．０岁。结核　性心包炎１２例，肿瘤性心包积液１１例，结缔组织疾病所致心　包积液５例，。肾功能衰竭所致心包积液３例，化脓性心包积液　心包积液可由多种病因所致，如肿瘤、结核、化脓性、亚　急性感染性心内膜炎（ＳＬＥ）等。近年来肿瘤性大量心包积　液的发病率明显增多，肿瘤（以肺癌、乳腺癌最常见）转移至　心包引起中至大量心包积液，进展较迅速，病情凶险，重者可　发生急性心包填塞而危及生命。传统的心包穿刺抽液是一　项较危险的操作技术，具有一定的并发症，这些并发症包括　心肌或冠状动脉损伤、严重心律失常、气胸、腹部器官损伤和　死亡　，其中致命的并发症发生率达１　１％一２０％　Ｊ。随着　二维超声心动图在积液定量、定位及引导穿刺中的应用，已　使心包穿刺的安全性有所提高，但是严重并发症仍时有发　生。本文对我院近四年来收治的３６例大量心包积液采用心　包内置管引流及传统穿刺抽液作对比研究，旨在探讨其疗　莫文庆邓虹王少军：连州市人民医院广东连州５１３４００　１例，不明原因的心包积液４例。全部病人均经超声心动图　证实均为大量心包积液”　。将上述病例随机分两组，传统心　包穿刺抽液１６例（抽液组），心包穿刺置管引流２０例（导管　组）。两组患者的年龄、性别、病种差异无统计学意义。　１．２传统心包穿刺抽液　采用剑突下穿刺点或心尖部穿刺点。１０例采用剑突下　穿刺点，６例采用心尖穿刺点。病人取坐位或半卧位，常规　（接上页）　应保存在冰箱冷藏条件下３～５天测完，需冷冻保存的不能　反复冻融，以免其滴度衰减。如需长期保存应冻在一７０　ｏＣ。　３．７本文的１００例血清标本全部得到确认，具有很好的效　果，是该确认方法在临床应用的一次佐证，说明了所使用的　确认试剂在临床试用中具有较好的灵敏度和特异性。在经　过更多的进一步临床试验之后，适合我国人群的ＨＢｓＡｇ确　认试验程序的建立和确认试剂能很快填补国内的这项空白，　以满足临床应用的迫切需求。　参考文献　［１］　方筠，张久春，陈健，等．乙型肝炎病毒表面抗原确认试验　方法的建立［Ｊ］．检验医学，２００６，２１：４７８—４８０．　［２］　中华人民共和国卫生部．中国生物制品规程（二部）［Ｓ］．北　京：化学工业出版社，２０００：５７４．　［４］　王岚，沈立松．不同方法检测乙肝血清标识物的结果比较　［Ｊ］．检验医学，２００４，１９：５３５—５３７．　［５］　李金明．感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的　确认［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００６，２９（７）：５７７—５８０．　［６］　陈慧英．酶联免疫吸附法测乙肝病毒表面抗原假阳性原因分　析及解决办法［Ｊ］．现代检验医学杂志，２００５，２０：８８．　［７］　陈慧英．对应用酶联免疫吸附试验检测肝炎病毒血清标志物　临界结果报告的探讨［Ｊ］．检验医学，２００６，２１（Ｓｕｐｐｅ１）：５４—　５６．　［８］　ＧＡＬＬ　Ｄ，ＮＩＥＩＪｓＥＮ　Ｋ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ　ｃｕｔｏｆｆ　ｖａｌｕｅｓ　ｆｏｒ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｓｓａｙｓ：ａ　ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｓｍｄｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓｌｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｎｉｓ—　ｔｒｙ，２００１，２２：８５—９８．　［９］　李金明．临床酶免疫测定技术［Ｍ］．北京：人民军医出版社，　２００５：９６—１０５．　［３］　陈慧英，张锦锋，岑小鹏，等．ＥＬＩＳＡ检测乙型肝炎ＨＢｓＡｇ室内　质控血清的试制和应用［Ｊ］．上海医学检验杂志，２０００，１５：２０３　—２０５．　［１Ｏ］翁志霞．乙肝病毒血清标志物检测中临界值的探讨［Ｊ］．江西　医学检验，２００２，２０：３２７—３２８．