一、仪器及试剂：
仪器：低温高速离心机；紫外分光光度计；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等
试剂：天根总RNA提取试剂盒；氯仿；无水乙醇等。 样品：大鼠外周血或单个核细胞等。
二、实验步骤(准备工作：RD和RW加无水乙醇)：
1、细胞悬液：离心去上清，5-10×106细胞加RZ 1ml(新鲜血液：0.25ml血+0.75mlRZ裂解液)，室温 5min；
2、 加 200ul 氯仿，震荡混匀 15s，室温 3min；
3、 4℃12000rpm 离心 10min，上层水相层转移至新管（无 RNase）中； 4、 加 0.5 倍体积（500ul）无水乙醇，混匀； 5、 上柱，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；
6、 加 500ulRD，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；
7、 加 600ulRW，室温 2min，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液； 8、 重复上一步；
9、 换新收集管，4℃12000rpm 离心 2min,弃废液； 10、 换新收集管，加 30-100ulRNase-free ddH2O，室温 2min，4℃12000rpm 离心 2min；
11、浓度及纯度检测； 12、保存在-70℃。
总 RNA逆转录成 cDNA
一、仪器及试剂：
仪器：低温高速离心机；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等
试剂：RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit。 样品：大鼠总RNA。
二、实验步骤：
1. 冰上充分溶解逆转录试剂盒中的相关试剂和 RNA。 2. 取 PCR 管，冰上依次加入以下试剂： Oligo(dT) 1ul 总 RNA 0.1 ng - 5 µg（1ul） 加 RNase-free 水至 12ul，混匀。 3. 4℃微离心（5000r/min×5sec） 。4. 置 PCR 管与 PCR仪中，65℃孵育5min，迅速置冰上，微离心。 5. 依次加入以下试剂：
5×reaction buffer 4ul RiboLock™ RNase Inhibitor (20 u/μl) 1ul 10 mM dNTP Mix 2ul
M-MLV 1ul 6. 混匀，4℃微离心。 7. 置 PCR 管于 PCR仪中，42℃孵育60min，再于 70℃孵育 5min，终止反应。 8. 合成的 cDNA 于-20℃保存一周备用。
普通PCR反应和琼脂糖电泳
一、仪器及试剂： 仪器：普通离心机；PCR仪；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等。
试剂：DNA Marker-B、2×PCR Master Mix、Ⅰ型核酸染色剂、GAPDH或β-actin引物、目的基因引物、上样缓冲液、1×TBE缓冲液、琼脂糖凝胶制胶板及梳齿等。
样品：cDNA、DNA。
二、实验步骤： 实验分三组：
实验组：（模板：cDNA；引物：目的基因）
阴性组：（模板：无；引物：GAPDH或β-actin） 阳性组：（模板：DNA；引物：GAPDH或β-actin）
PCR反应（25ul）：
1. 冰上依次加入以下试剂： 2×PCR Master Mix 12.5µl 模板DNA 1ul 上游引物 0.5ul 下游引物 0.5ul RNase-free ddH2O 10.5ul
混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪。
2. 反应条件：
（1）94℃预变性 5min。 （2）94℃变性 30sec Tm 温度退火 30sec 72℃延伸 5min 以上步骤 35 个循环。
琼脂糖凝胶电泳（2%的凝胶）：
1. 称取0.4g琼脂糖，加入1×TBE20ml，摇匀，微波炉中加热1分钟； 2. 溶液稍冷却后至60℃，加入5ul核酸染料；
3. 胶块制作好后，向加样孔中加入DNA maker 5ul；加样孔加PCR产物10ul； 4. 电泳：电压100V，电流100mA，恒压电泳，时间45min，不跑出胶为限。 5. 将胶置于凝胶成像系统拍照保存。
荧光定量PCR
试剂：2 x Sybr Green qPCR Mix
实验步骤： 实验分三组：
实验组：（模板：cDNA；引物：目的基因）
阴性组：（模板：无；引物：GAPDH或β-actin） 内参：（模板：cDNA；引物：GAPDH或β-actin）
PCR反应（50ul）：
1. 冰上依次加入以下试剂：
2 x SYBR qPCR Mix 25 ul DNA Template 2 ul Forward Primer (10 μM) 1 ul Reverse Primer (10 μM) 1 ul 加ddH2O至总体积 50 ul
PCR 循环（三步法） 94℃ 5 min 94℃ 15 sec
55-65℃ 15 sec 40cycles 72℃ 35 sec 72℃ 5min
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