第一章绪论分子生物学分子生物学的根本含义(p8)分子生物学是研究核酸、 蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的根底学科。分子生物学与其它学科的关系分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并开展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切:生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学那么着重说明生命的本质----主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。
细胞生物学与分子生物学关系也十分密切:传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。探讨组成细胞的分子结构比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能，因此现代细胞生物学的开展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。分子生物学那么是从研究各个生物大分子的结构入手，但各个分子不能孤立发挥作用，生命绝非组成成分的随意加和或混合，分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反响的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。第一章序论1859年发表了?物种起源?，用事实证明“物竞天择，适者生存〞的进化论思想。指出：物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否认了“创世说〞。达尔文第一个认识到生物世界的不连续性。
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意义：达尔文关于生物进化的学说及其唯物主义的物种起源理论，是生物科学史上最伟大的创举之一，具有不可磨灭的奉献。细胞学说细胞学说的建立及其意义德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的， 细胞是一切动植物的根本单位。经典遗传学两条根本规律:统一律：当两种不同植物杂交时，它们的下一代可能与亲本之一完全相同；别离规律：将不同植物品种杂交后的F1代种子再进行杂交或自交时，下一代就会按照一定的比例别离，因而具有不同的形式。1865年发表?植物杂交试验?，直到1900年才被人们重新发现。孟德尔被公认为经典遗传学的奠基人。现代遗传学Morgan及其助手第一次将代表某一特性的基因同染色体联系起来，使科学界普遍认识了染色体的重要性并接受了孟德尔的遗传学原理。Morgan特别指出：种质必须由某些独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子或基因。第二节分子生物学开展简史准备和酝酿阶段〔19世纪后期到20世纪50年代初〕对生命本质的认识上的两点重大突破：1．确定了蛋白质是生命的主要根底物质2．确定了生物遗传的物质根底是DNA现代分子生物学的建立和开展阶段〔20世纪50年代初到70年代初〕这一阶段以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学根本理论建立和开展的黄金时代。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法那么的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识DNA双螺旋发现的意义：
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确立了核酸作为信息分子的结构根底；提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的根本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质根底，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的根底。Crick于1954年所提出遗传信息传递的中心法那么〔CentralDogma〕：初步认识生命本质并开始改造生命的深入开展阶段〔20世纪70年代后至今〕基因工程技术的出现作为标志。其间的重大成就包括：重组DNA技术的建立和开展基因组研究的开展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和开展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第三节分子生物学的主要研究内容一．DNA重组技术〔recombinantDNAtechnology〕定义：又称为基因工程，根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的遗传物质DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组技术的应用：利用微生物基因工程生产重组基因工程药物转基因植物和动物体细胞克隆基因表达与调控的根底研究二．生物大分子的结构功能研究三．基因组、功能基因组与生物信息学的研究基因组、蛋白质组与生物信息学基因组(Genome)：细胞或生物体一条完整单体的全部染色体遗传物质的总和。人类基因组方案〔HumanGenomeProject,HGP〕：测定出人基因组全部DNA3109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因的一级结构。基因组、蛋白质组与生物信息学蛋白组方案〔Proteomeproject〕:又称为后基因组方案或功能基因组方案，用于揭示并说明细胞、组织乃至整个生物个体全部蛋白质及其功能。生物信息学〔Bioinformatics〕:是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。四．基因表达调控研究
第二章染色体与DNA3
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本章内容染色体DNA的结构DNA的复制原核生物和真核生物DNA复制特点DNA的修复DNA的转座第一节染色体(chromosome)概念：染色体(chromosome)：原指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质。现在这一概念已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。染色质(chromatin)：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。常染色质(euchromatin)：是进行活泼转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点(hypersensitivesites)降解。
异染色质(heterochromatin)：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质(inactivechromatin)，是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现象
(heteropycnosis)。原核细胞与真核细胞特征分析染色体特性：分子结构相对稳定能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程
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能够产生可遗传的变异
真核细胞染色体的组成
DNA
组蛋白(histone) 非组蛋白(NHP)
少量RNA
染色体中的蛋白质
30%--40%
30%--40%
变化很大
组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。 组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。非组蛋白(non-histoneprotein)：是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白。
组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性。2、无组织特异性。3、肽链上氨基酸分布的不对称性。4、组蛋白的修饰作用。5、富含赖氨酸的组蛋白H5。非组蛋白：非组蛋白大约占组蛋白总量的60－70%，种类很多。1〕HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)，能与DNA结合(不牢固)，也能与H1作用,可能与DNA的超螺旋结构有关。
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2〕DNA结合蛋白：可能是一些与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质。3〕A24非组蛋白：与H2A差不多，位于核小体内，功能不祥。非组蛋白的一般特性：1.非组蛋白的多样性；
非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。DNAC值：通常指一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象：真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象〞。染色体中的 DNA根据DNA的动力学研究，真核细胞DNA可分为：高度重复序列：几百→几万copy。如：卫星 DNA和微卫星DNA。中度重复序列： 10→几百
copy。如：各种 rDNA、tDNA及组蛋白基因。低度重复序列：2→10copy。如：血红蛋白。单拷贝序列：大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。如：蛋清蛋白。染色体折叠DNA核小体螺线管
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圆筒超螺旋
〔1〕核小体染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体(nucleosome)：DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外周(146bp)，形成核小体核心颗粒。
〔2〕螺线管10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝，通称螺线管〔solenoid〕。螺线管的每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为6。这种螺线管是分裂间期染色质和分裂中期染色体的根本组分。〔3〕上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由30nm螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒，直径为4000nm，压缩比是40。〔4〕超螺旋进一步压缩 1/5便成为染色体单体，总压缩比是
7×6×40×5，将近一万倍。原核生物基因组特点：1、结构简练2、存在转录单元多顺反子mRNA3、有重叠基因Sanger1977在?Nature?上发表了ΦX174DNA的全部核苷酸序列，正式发现了重叠基因。第二节
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DNA的结构
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一、DNA的一级结构所谓DNA的一级结构，就是指 4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。根本特点①DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成根本骨架，碱基排列在内侧。③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤〔A〕只能与胸腺嘧啶〔T〕配对，鸟嘌呤〔G〕只能与胞嘧啶〔C〕配对。
2、DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。3、DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示：L=T+W其中L为连接数〔linkingnumber〕，是指环形 DNA分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，L是个常量。T为双螺旋的盘绕数〔twistingnumber〕，W为超螺旋数〔writhingnumber〕，它们是变量。2．3DNA的复制DNA的半保存复制机理复制的起点、方向和速度
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复制的几种主要方式
一、DNA的复制1、DNA的半保存复制每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链那么是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA的半保存复制〔semiconservativereplication〕。DNA的这种半保存复制保证了DNA在代谢上的稳定性。2、复制的起点与方向一般把生物体的复制单位称为复制子〔replicon〕。一个复制子只含一个复制起点。多复制子：DNA复制时，原核生物一般只有一个起始位点，而真核生物那么有多个起始位点，因而在复制时呈现多复制泡，也称为多复制子。DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的〔图2-18〕。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。拓扑异构酶I拓扑异构酶I解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。参与解链的除一组解链酶外，还有Dna蛋白等。DNA解链酶〔DNAhelicase〕DNA解链酶能通过水解 ATP获得能量来解开双链DNA。
单链结合蛋白〔 SSB蛋白〕SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。
3、DNA的半不连续复制与冈崎片段
DNA复制时，短时间内合成的约1000
fragment)
个核苷酸左右的小片段，称之为冈崎片段
(Okazaki
DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，
在一般原核生物的冈崎片段要长些，
然后再由连接酶连成大分子 DNA。现
真核生物中的要短些。 进一步研究还证明，这种前
导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有因而称之为双螺旋的普遍性的， 半不连
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续复制。DNA链的延伸：DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。4、滞后链的引发DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在 RNA引物3'端开始合成新的
DNA模板上合成一段
RNA引物，再由DNA聚合酶从
DNA链。滞后链的引发过程往往由引发体〔primosome〕来完成。
引发体由6种蛋白质n、n'、n''、DnaB、C和I共同组成，只有当引发前体〔preprimosome〕把这6种蛋白质合在一起并与引发酶〔primase〕进一步组装后形成引发体，才能发挥其成效。5、链的终止当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列〔
Ter〕时，Ter-Tus复合物能阻挡
复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。6、复制的几种方式环状DNA双链的复制环状双链DNA的复制可分为θ型、滚环型和D-环型几种类型。θ型复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。(b)滚环型〔rollingcircle〕这是单向复制的特殊方式。如ΦX174的双链环状 DNA复制型〔RF〕就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5‘端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。在这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。〔c〕D-环型〔D-loop〕这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补
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链，另一条链那么成为游离的单链环〔即D-环〕。〔2〕线性DNA双链的复制线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下 5'端局部单链
DNA，不能为 DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。T4和T7
噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3'端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体，并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的复制特点1、原核生物 DNA的复制特点
大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比拟原核生物的 DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有 3’→5’外切酶活性和
5’→3’外切酶活性。保证DNA复制的准确性。DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’
核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ：7种亚单位9个亚基。只具3’→5’外切酶活性，主导聚合酶。Klenowfragment：用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶，获得两个片段，大片段分子量76000U，称为Klenow片段。它保存着聚合酶和3’→5’外切酶的活性，广泛使用于DNA序列分析中。
三、真核生物 DNA的复制特点真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物〔ORC〕参与。真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp秒，还不到大肠杆菌的120。真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。真核生物DNA聚合酶的特性比拟
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2.4.3 DNA复制的调控原核细胞DNA的复制调控：复制叉的多少决定了复制频率的上下。真核细
胞DNA的复制调控：1.细胞生活周期水平调控2.染色体水平调控3.复制子水平调控真核和原核生物DNA复制的比拟相同：1.半保存复制2.都有引发、延长、终止三个阶段3.都必须有相应功能的蛋白质和DNA聚合酶参与区别：1.真：多个复制起始点；原：一个复制起始点2.真：所有复制受一种调控；原：一个复制子上有多个复制叉
DNA的修复 DNA修复系统
错配修复
碱基切除修复
核苷酸切除修复
DNA直接修复
DNA的转座
转座子的分类和 结构特征
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功能
恢复错配
切除突变的碱基 修复被破坏的DNA 修复嘧啶二体或甲基
化DNA
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转座作用的机
制
转座作用的遗 传学效应
真核生物中的 转座子
移动基因(Movablegene)：又称为转位因子(Transposableelements)，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的根本单位。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此有时也称为跳跃基因(Jumpinggene)。原核生物的转座因子可分为：
插入序列(insertionsequence，IS)：最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。片段长度 700
—2500bp。复合转座子(transposon，Tn)：是一类携带某些与转座无关的抗性基因(或其它宿主基因)的转座子。分子量＞2000bp。转座噬菌体(Mu，D108)：具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。插入序列的结构特点：1.在IS两端含有长度为 10—40bp反向重叠序列2.含有一个编码转座酶的长编码区。3.插入时在 DNA位点产生一个短的(3—9bp)正向重复序列。复合转座子的结构特点：1.两翼为两个相同或相似的IS序列。2.中部为某种抗性基因。序列一般不能单独移动。Conclusiona) 转座过程是由Donor提供Tncopy到targetsite，涉及酶切、复制、重组的遗传学过程。13
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b)座完成后，在Tn的两端出targetsite序列的正向重复，其度取决于staggeredcutting的度。座因子的IR序列是座的重要位点，与座，切除有关d)Cointegrater是座程的中体(具有两个Tn和两个replicon),其定性依Tn不同而异，或resolution完成座程.e)Cointegrater可能致Tn和抗性的累。座作用的学效
1.
2.
3.
4.
5.
效
效 切除
⋯〕
〔提高重率、形成易基因
(倒位、缺失、重复、footprinting)
exonshuffli
双座效〔外子改 ng〕
位置效〔启表达、增表达⋯〕
座爆炸〔激活表达、基因内重排突基因形成〕
位作用的机制：靶序列的复制。位作用的学效：引起插入突；生新基因；生染色体畸；引起生物化。座因子的用：利用座子别离、 克隆基因；利用Tn行基因定位；作基因移体。真核生物中的座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和座的功能；非自主性因子：独存在是定的，不能座，当基因中存在与非自主性因子同家族的自主性因子，它才具座功能，成与自主性因子相同的座子。Ac－Ds体系、Spm,En座子。2、果中的座子
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Copia类、P转座子等。本章重点
染色体及DNA结构DNA复制习题以半保存方式进行复制,假设一完全被标记的DNA分子,置于无放射标记的溶液中复制两代,所产生的4个DNA分子中放射性状况如何A.两个分子有放射性 ,两个分子无放射性B.均有放射性C.两条链中的半条具有放射性D.两条链中的一条具有放射性E.均无放射性复制时哪种酶不需要指导的DNA聚合酶指导的RNA聚合酶C.连接酶指导的DNA聚合酶E.拓扑异构酶3.原核生物的 DNA聚合酶A.DNA 聚合酶Ⅰ有 7种、9个亚单位聚合酶Ⅱ有最强的外切核酸酶的活性聚合酶Ⅲ是真正的起复制作用的酶D.催化过程产生的焦磷酸是主要底物E.用4种脱氧核苷作底物生物信息的传递
(上)—从DNA到RNA基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。转
录(transcription)：以DNA为模板，按照碱基互补原那么合成一条单链RNA，从而将 DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称为转录。编码链(codingstrand)=有意义链模板链(templatestrand)=反义链
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不对称转录(asymmetrictranscription)：转录仅发生在DNA的一条链上。启动子(promoter)：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确的结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。终止子(terminator)：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。3.1 包括：
RNA的转录转录的根本过程都
模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。1、模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子 DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子
附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。2、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。3、转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。4、RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。5、当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物别离，这就是转录的终止。转录的根本过程RNA合成的根本特点：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键的碱基顺序由 DNA的顺序决定4.仅以一条
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DNA链作为模板
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5.合成方向为 5’→3’6.合成中不需要引物转录机器的主要成分原核生物RNA聚合酶：亚基 因相对分子量
基
亚基数组分功能αrpoA×1042核心酶核心酶组装，启动子识别βrpoB×1051核心酶
β和β’共同形成RNA合成的活性中心
’
βr
poC
核
×105
1
心酶
r
σpoD
于识别不同的启动子17
11×104
1 酶
1
子核心
σ因
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未知
存在多种
×104
σ因子，用现代分子生物学笔记朱玉贤第三版
1、RNA聚合酶大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后那么成为聚合酶全酶〔holoenzyme〕，相对分子质量为×105。研究发现，由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，参加σ因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，
转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在σ因子的释放。过去认为二核苷酸的形成就是转录起始的终止，实际上，只有当新生RNA链到达6-9个核苷酸时才能形成稳定的酶-DNA-RNA三元复合物，才释放σ因子，转录进入延伸期。真核生物RNA聚合酶真核生物中共有3类RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。
除了细胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的
酶。线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于 聚合酶之一，与T7
菌中的聚合酶相似，
噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体
RNA聚
合
7×104，是最小的RNA RNA聚合酶比拟大，结构
上与细
由多个亚基组成，局部亚基由叶绿体基因组编码。线粒体和叶
绿体RNA
聚合酶活性不受α-鹅膏覃碱所抑制。常用的转录抑制剂及其作用：抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与β亚基结合，阻止起始链霉溶菌素细菌的核心酶与β亚基结合，阻止延长
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放线菌素 D真核RNA聚合酶Ⅰ与DNA结合，并阻止延长α-鹅膏蕈碱真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅱ结合起始复合物的形成转录可被分为4个阶段，即启动子的选择、转录起始、RNA链的延伸和终止。原核生物中：启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物〔closedcomplex〕。真核生物RNA聚合酶Ⅱ所形成的转录起始复合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与一般情况下，该复合物可以进入两条不同的反响途径，一是合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；二是尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。RNA聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位点。只有带б因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。б因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。真核生物RNAPolII的转录起始复合物真核生物转录起始除RNA聚合酶外，至少还需要7种辅助因子参与，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。
启动子与转录起始2、启动子与转录起始启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与范本DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
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转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。 启动子区的根本结构转录单元(transcriptionunit)：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游
(upstream)，而把其后面即3’末端的序列称为下游(downstream)。在启动子区
内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区
(Pribnowbox)，这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。绝大局部启动子都存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区。这两段共同序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。Pribnow区〔Pribnowbox〕这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。
TTGACA。这个区的中央大约位于起点上游35bp处，所以又称为– 35区。
–10位的TATA区和–35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区〔Hognessbox〕，这是位于转录起始点上游–25～–30bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区〔图3-7〕。
另外，在起始位点上游–70～–78bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35bp区相对应的序列，称为CAAT区〔CAATbox〕。
在–70～–80区含有CCAAT序列〔CAATbox〕，在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列〔GCbox〕。
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启动子区的识别氢键互补学说：RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实。酶与启动子区的结合在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。RNA聚合酶既是双链 DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。3.2.4 10区和-35区的最正确间距
在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变(down mutation)，如果把
Pribnow区从
-
TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平；另一类突变叫上升突变(upmutation)，即增加Pribnow区共同序列的同一性。增强子及其功能能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与范本DNA相结合，起始基因转录。增强子与启动子的区别：1.增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动；2.它能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。真核生物启动子对转录的影响习惯上，将 游的保守序列称为上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE)
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TATA区上
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或称上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区〔Hognessbox〕，这是位于转录起始点上游–25～–30bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区。
另外，在起始位点上游–70～–78bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35bp区相对应的序列，称为CAAT区〔CAATbox〕。
在–70～–80区含有CCAAT序列〔CAATbox〕，在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列〔GCbox〕。
TATA区的主要作用是使转录精确地起始；CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，根本不参与起始位点确实定。转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。转录的终止RNA聚合酶起始基因转录后，它就会沿着范本5’→3’方向不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生
RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体
的氢键都必须被破坏，范本DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。终止和抗终止不依赖于ρ因子的终止终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的 RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构〔至少6bp〕和寡聚U序列〔至少 4个U〕长度的增加，终止效率逐步提高。依赖于ρ因子的终止ρ因子是一个相对分子质量为×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷酸三磷酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。抗终止
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抗转录终止主要有两种方式：1.破坏终止位点 RNA的茎—环结构2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止原核生物与真核生物mRNA的特征比拟
原核生物
mRNA的特征mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右〔tRNA占16%，
而rRNA那么占80%以上〕。原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。一个原核细胞的mRNA〔包括病毒〕有时可以编码几个多肽。原核生物 mRNA的特征1.原核生物 原核生物
mRNA的半衰期短2.许多
mRNA以多顺反子的形式存在3.原核生物 mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)结构4.原核生物起始密码子AUG上
游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列〔Shine–Dalgarnosequence〕的保守区，因为该序列与16S-rRNA3’端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA〔monocistronicmRNA〕，把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA
〔polycistronicmRNA〕。多顺反子 mRNA是一组相邻或相互重迭基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子〔operon〕，是生物体内的重要遗传单位。如大肠杆菌乳糖操纵子转录成编码3条多肽的多顺反子 生物
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mRNA，经过翻译生成β半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶。真核mRNA的特征前体RNA成熟mRNA
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“基因〞的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！真核生物
mRNA的特征1.真核生物
mRNA的5’端存在“帽子〞结构： pppApNpNp。绝大多数真核生物
mRNA具有多聚(A)尾巴。帽子结构帽子被扣在了mRNA的5’端，并可能在几个位置发生甲基化。mRNA5′端加“G〞的反响是由鸟苷酸转移酶完成的。帽子甲基化作用帽子0：出现在所有真核生物中。尿苷酸一 7一甲基转移酶在G的7N位甲基化帽子1：除单细胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。
2’一甲基一转移酶
第2个2’－OH位置上〔实际上在任何修饰反响进行前，它是转录物中碱基的
原来的第
个碱基〕
帽子2：甲基基团可以添mRNA的第3碱基上。这个反响的底物是已经加到戴帽 具有两个
甲基基团的帽子
mRNA。
2’一甲基一转移酶催化2’－OH位置上甲基化
这种帽子通常低于戴帽群体总量的10－15％。二、mRNA的转录后修饰－--------帽子1、帽子的种类帽子0〔Cap-0〕m7GpppXpYp----------〔共有〕24
24
1
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帽子 1〔Cap-1〕m7GpppXmpYp----------第一个核苷酸的2’-O位上产生甲基化〔AN6位甲基化〕帽子2〔Cap-2〕m7GpppXmpYm第二个核苷酸的2’-O位上产生甲基化〔A、G、C、U〕其中:☆单细胞真核生物只有Cap—0Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子结构的生成☆甲基供体都为
S—腺苷甲硫氨酸〔SAM〕RNA鸟苷酸转移酶-----戴帽酶〔cappingenzyme〕
3、帽子结构的功能1〕对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号Cap—0的全部都是识别的重要信号Cap—1,2的甲基化能增进识别2〕增加mRNA的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击3〕与某些RNA病毒的正链合成有关〔Cap—1、Cap—2〕
（
除帽子结构外的内部甲基化－－－ m6A形式PolyA尾巴3、poly(A)的功能1〕可能
与核质转运有关2〕与mRNA的寿命有关
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〔3〕与翻译有关a、缺失可抑制体外翻译的起始b、胚胎发育中， poly(A)对其mRNA的翻译有影响〔非poly(A)化的为储藏形式〕c、对含
poly(A)的mRNA 失去poly(A)可减弱其翻译〔4〕
oligo(dT)与载体相连，从总体RNA中别离
poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值a、也可将
纯化mRNAb、用寡聚dT〔oligo(dT)〕为引物，反转录合成cDNA
假设干根本概念基因表达的第一步以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下
按A＝U，C＝G配对的原那么，合成RNA分子模板单链DNA的极性方向为3’→5’,而非模板单链DNA的极性方向与 RNA链相同，均为5’→3’.模板单链DNA的极性方向为 3’→ 链DNA的极性方向与 RNA链相同，均为5’→3’.内含子的剪接、编辑及化学修饰
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5’,而非模板单
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一、概述割裂基因〔splitgene〕：指某一 RNA序列中，成熟
RNA的基因中有些序列并不出在成熟的
RNA的序列在基因中被其他的序列隔开内含子〔intron〕：原初物中通RNA拼接
反而被去除的RNA序列或基因中与些RNA序列相的DNA序列外子〔excon〕：RNA拼接〔RNAsplicing〕：一个基因的外子和内含子共同在一条物中，将内含子去除而把外子接起来形成成熟RNA分子的程拼接点：5’拼接点或左拼接点〔内含子上游〕3’拼接点或右拼接点〔⋯⋯下游〕3.5.1 RNA中的内含子真核生物mRNA前体的加工：5’端形成特殊的帽子构2.在3’端切断并加上一个 poly(A)的尾巴通剪接除去来的IVS(非翻区)内部核酸的甲基化内含子的分中部核心构〔centralcorestructure〕:在有些内含子中，含有4个重复的保守序列，度10~20bp，4个保守序列构成一种二构，在拼接中起重要作用由于并非所有的内含子都有中部核心构，所以有了内含子的分Ⅰ〔groupⅠ〕:含有中部核心构的胞器基因核基因Ⅱ〔groupⅡ〕:不含有中部核心构胞器粒体基因内核基因Ⅲ〔groupⅢ〕:具有GU－AG特征的界序列核基因mRNA前体
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RNA基因的内元均位于tRNA的反密码环上3、拼接方式方式一：由拼接装置完成〔核mRNA内含子〕可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二：自我拼接〔两类内含子Ⅰ、Ⅱ〕形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白质酶参与的拼接〔酵母tRNA〕前两种拼接都属于转酯反响3.5.2 RNA的剪接RNA的剪接实质：就是要把断裂基因的内含子除去，连接外显子。
剪切方式：mRNA前体的剪接；自我剪接；蛋白质剪接(tRNA)。剪接体(spliceosome)：各种参与剪接的成分形成的一个体系。Ribozyme：有酶活性的RNA。
拼接机制〔Splicingmehanism)
SnRNA(orScRNA)与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接,形成拼接体(spliceosome)。Spliceosome逐级组装，SnRNA〔U1、U2、U5和U4／U6〕分步替代U1通过5，拼接点互补而结合U2识别并结合分支点 AU1和U2作用使内元的5’端和
3’端带到一起〔U1与3’拼接点配对〕U1、U2、mRNA与U4－
U5－U6复合物形成一个完整的拼接体3.5.3 RNA的编辑和化学修饰RNA的编辑：是在mRNA水平上改变遗传信息的过程。种类：单碱基突变；尿苷酸的缺失和添加
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化学修饰：甲基化；硫代；二价键的饱和化； 去氨基化；碱基的同分异构化；核苷酸的替代。习题1.真核生物的
TATA盒是:A.转录的起始点B.翻译的起始点聚合酶与DNA模板稳定结合处聚合酶的活
性中心合成起始位点2.关于RNA的表达,错误的选项是:A.主要有mRNA、tRNA、rRNA三大类B.胞质中只有一种 RNA，即mRNAC.最小的一种RNA是tRNAD.原核生物没有hnRNAE.原核生物没有 snRNA3.真核细胞中
mRNA的加工修饰不包括:A.在mRNA3’末端加 polyA尾的前体是核内hnRNAC.在mRNA5’端形
成 7甲基鸟苷酸帽子结构D.除去非结构信息局部
E.不同RNA片段之间
的拼接
4.绝大多数mRNA5’端
真核生物
有:
A.帽式C.起始D.启结构
A
密码子
动子
序列
5.snRNA的功能是:B
A.参与复C.激活聚D.形成核DNA
制
B.参与RNA剪接
RNA
合酶
糖体
rRNA的前体
6.核酶(ribozyme)的底物是:
C.D.细胞E.核
核糖体
核膜
蛋白
7.反义核酸作用主要是:A.封闭DNAB.封闭RNAC.降解DNAD.降解RNAE.封闭核糖体29
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E.是
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8.转录与DNA复制过程的共同点是:A.需要DNA聚合酶B.所用模板相同C.所用原料相同D.所得产物相同E.需要RNA聚合酶1.真核生物 mRNA转录后的成熟步骤主要包括
①5’端形成特殊的帽子结构②在3’端切断并加上一个
poly(A)的尾巴③通过剪接除去转录来
的IVS(非翻译区)④链内部核酸的甲基化生物信息的传递 (下)—从mRNA到蛋白质遗传密码—三联子1、mRNA与蛋白质之间的联络是经过遗传密码的破译来完成的三联子密码及其破译遗传密码(code)：mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码,密码是密码子的总和。密码子(codon)：mRNA中每个相邻的三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子。阅读框(readingframe)：遗传密码是三个一读，称为阅读框。AUG：蛋氨酸(Met)或起始密码UAA、UAG、UGA：终止密码UAG—琥珀型(amber)密码子UGA—蛋白石(opal)密码子UAA—赭石型(ochre)密码子三联体密码的破译：
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以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指点多肽的分解核糖体结合技术遗传密码的性质1.密码的简并性：
简并(Degenracy)：由一种以上密码子编码同一种氨基酸的景象称为简并。同义密码子
(Synonymouscodons)：对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。2.密码的普遍性与特殊性：普遍性：无论在体外还是体内，也无论是病毒、细菌、植物还是植物，遗传密码均适用。特殊性：线粒体密码子，其它例外(支原体、四膜虫
)线粒体mRNA中的密码子：与胞浆中
mRNA的密码子有三点不
同(哺乳植物)：1.线粒体中 UGA不代表终止密码子，而是编码Trp；2.由AUG和AUA二个密码子编码；和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子，即UAA、UAG、AGA和AGG均为终止密码子。密码子与反密码子的互相作用：反密码子(anticodon)：指tRNA上能识别一个mRNA密码子的地位，这个地位上的碱基与密码子的碱基是互补的。所谓“摆动假说〞(Wobblehypothesis)：即密码的第一、第二碱基是必需严厉依照标准配对(A-U、G-C)，而第三碱基那么可以有一定水平的摆动灵敏性。Wobblehypothesis：1.恣意一个密码子的前两位碱基都与tRNAanticodon中的相应碱基构成
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Watson-Crick碱基配对。
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2.反密码子第一位是 A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine(I)作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3.假设数个密码子同时编码一个氨基酸，但凡第一、二位碱基不相反的密码子都对应于各自的tRNA。4.依据上述规那么，至多需求32种不同的tRNA才干翻译61个codons(密码子)。密码子—反密码子配对摆动的准绳：反密码子 5’端密码子3’端GUorCCGonlyAUonlyUAorGIU，CorA遗传密码子的根本特点：1.每个密码子三联体(triplet)决议一种氨基酸；2.两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以别离，即密码子无逗号；3.密码子具无方向性，从N端到C端；4.密码子有简并性；5.共有64个密码子，其中有 1个起始密码子和3个终止密码子；6.密码子有通用性，即不管是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相反的。二、tRNAtRNA的二级构造(三叶草构造)
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3’端含CCA-OH序列TψC环(TψCloop)：7个碱基3.额定环(extrovariableloop)：3-18个碱基4.反密码环(anticodonloop)：7个碱基5.二氢尿嘧啶环 (dihydr-Uloop或D-loop)：8-12个碱基6.螺旋区：4-5个碱基tRNAtRNA的L形三级构造tRNA的三级构造次要由在二级构造中未配对碱基间构成氢键而引发的。在三叶草构造中的氢键被称为次级氢键，在三级构造中的就称为三级氢键。大局部恒定或半恒定核苷酸都参与三级氢键的构成。tRNA的功用在蛋白质生物分解进程中，tRNA次要起转运氨基酸的作用。tRNA上与多肽链分解有关的位点：3’端—CCA上的氨基酸承受位点识别氨酰tRNA分解酶的位点核糖体识别位点反密码子位点tRNA的品种
起始tRNA；延伸tRNA；同工tRNA；校正tRNA。33
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校正tRNA：分为无义渐变及错义渐变校正在蛋白质的构造基因中，一个核苷酸的改动能够使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质分解提早终止，分解无功用的或有意义的多肽，这种渐变就称为无义渐变。错义渐变：由于构造基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。氨酰– tRNA分解酶
是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反响式如下：AA+tRNA+ATP →AA-tRNA+AMP+PPi它实践上包括两步反响：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶〔E〕→ E-AA-AMP+PPi
第二步是氨酰基转移到tRNA3末端腺苷残基的2或3-羟基上。E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP核糖体核糖体的功用核糖体的构造
由几十种蛋白质和几种rRNA组成。包括两个亚基，大亚基约为小亚基绝对分子质量的一倍。每个亚基包括一个次要的rRNA成分和许多不同功用的蛋白质分子。核糖体上有不止一个的活性中心，每一个这样的中心都由一组特殊的蛋白质构成。核糖体的根本功用依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着增强rRNA功用的作用。多聚核糖体(polyribosome)：在执行蛋白质分解功用时，单个核糖核蛋白体常
常5-6个或更多
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个串联在一同，构成一个聚合体，称为多核蛋白体或多核糖体(polyribosome或polysome)。rRNArRNA的根本特点1.rRNA是单链RNA。碱基对与A-U碱基对的总量不等。3.单股rRNA链可自行折叠，构成螺旋区和环区，一切螺旋区的碱基都是保守的。4.一切来源rRNA均能构成4个构造域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每个构造域均含许多茎(螺旋段)和环，它们经过无间隔碱基对的互相反响彼此接近。5.绝大少数的rRNA碱基的特异功用尚不清楚。rRNA1、5SrRNA:含与tRNA和23SrRNA识别序列2、16SrRNA：含与mRNA5’端和23SrRNA互补序列。3、23SrRNA：存在一段能与tRNAMet序列互补的片段，5SrRNA互补序列。4、rRNA：与tRNA作用的识别序列，同5SrRNA。5、18SrRNA：与16SrRNA同源。6、28SrRNA核糖体的功用
核糖体必需包括至多5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或承受AA-tRNA部位〔A位〕、结合或承受肽基tRNA的部位、肽基转移部位〔P位〕及构成肽键的部位〔转肽酶中心〕。核糖体小亚基担任对模板mRNA停止序列特异性识别，如起始局部的识别、密码子与反密码子的互相作用等，mRNA的结合位点也在此亚基上大亚基担任携带氨基酸及tRNA的功用，肽键的构成、 AA-tRNA、肽基-tRNA的结合
等，A
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位、P位、转肽酶中心等次要在大亚基上。蛋白质合成的生物学机制 氨基酸的活化
氨基酸必须在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤，因为只要tRNA携带了正确的氨基酸，
多肽合成的准确性就相对有了保障。 翻译的起始
起始密码子和起始信号：
上的起始密码子常为 AUG，少数为GUG
在mRNA起始密码子上游8-13个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，称为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它和16SrRNA3’端有一个互补的序列，它们互相
识别，以保证起始的正确性。
Eukaryoticribosomesmigratefromthe5endofmRNAtotheribosomebindingsite, whichincludesanAUGinitiationcodon. 翻译的起始 ：
第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，再在SD序列的帮助下与mRNA 模板结合。
第二步，在 IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet 进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
第三步，带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水 解，释放翻译起始因子。36
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原核生物的翻译的起始因子： IF-1加强IF-2，IF-3的酶活
IF-295kd-117kd促使fMet-tRNAfMet 选择性的结合在30S亚基上IF-320kd促使30S亚基结合于mRNA起始局部，阻碍30S与50S亚基的
结合 真核生物
蛋白质生物合成的起始机制与原核生物根本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5'端的“帽
子〞参与形成翻译起始复合物。 真核生物的翻译的起始因子：
eIF23种亚基形成三元起始复合体(eIF2,GTP,tRNA)eIF2-A65kdMet-tRNAmet与40S亚基结 合
eIF115kd促使mRNA与40S亚 基结合
eIF3＞500kd促使mRNA与40S亚基结合eIF4b80kd促使mRNA与40S亚基 结合37
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eIF4a50kd促使与mRNA，GTP结 合
eIF4c19kd
促使两亚基结合 eIF5150kd释 放eIF2，eIF3
eIF4e(eIF4f 的亚基)与5’端帽子结合肽链的延伸 过程：后续AA-tRNA与核糖体结合 肽链的生成 移位
延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物) EF-1,EF-2(真核生物) 2个GTP
后续AA-tRNA与核糖体结合
细菌中肽链延伸的第一步反响：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰 形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生 GDP并在EF-Ts的作用下释放分子GTP，进入新一轮循环。
肽键的生成38
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-tRNA首先与EF-Tu·GTPGDP并使EF-Tu结合另一 现代分子生物学笔记朱玉贤第三版
核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位。在肽基转
Met
移酶
〔peptidyltransferase 上的氨基酸生成肽键。起始
〕的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNA
tRNA在完成使命后离开核糖体
P位点，A位点准备接受新的
AA-tRNA，开始下一轮合成反响。
移位
肽键延伸过程中最后一步反响是移位，即核糖体向mRNA3'端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA2从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA
上的第三位密码子那么对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。
肽链的终止 终止因子：
原核生物有 3种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于识别终止密码子UAA、UAG；RF2帮助识别UAA、UAG；RF3不识别终止密码子，主要是协助肽的释放。一旦tRNA从核糖体上脱落，那么核糖体立即离开mRNA，并解离成50S和30S亚基，核糖体可以重复使用。
真核生物仅一种：RF 蛋白质前体的加工 端fMet或Met的切除
二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成
2.
特定氨基酸的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化切除新生肽链中的
非功能片段
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糖蛋白中常见的糖—肽连接键：
N—糖苷键：β-N-乙酰氨基葡萄糖基 -天冬酰胺(GlcNAc-Asn)
O—糖苷键：α-N-乙酰氨基半乳糖基 -丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr) 蛋白质合成的抑制剂 抗生素类阻断剂：
链霉素、卡那霉素、新霉素等：竞争性抑制蛋白质合成 四环素和土霉素：四环素阻止氨酰-tRNA转移到A位置 氯霉素：阻断50S亚基的活性 嘌呤霉素(Puromycin)
白喉霉素(diphtheriatoxin)：与延长因子发生作用 干扰素对病毒蛋白合成的抑制：
从白细胞中得到α-干扰素，从成纤维细胞中得到β-干扰素，在免疫细胞中得到素。
抗生素抑制蛋白质生物合成的原理 抗生素作用 点作用原理
四环素族原核核蛋白体小亚基抑制氨酰-tRNA与小亚基结 合40
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-干扰γ 现代分子生物学笔记朱玉贤第三版
氯霉素原核核蛋白体大亚基抑制转肽酶，阻断延 长
链霉素/卡那霉素原核核蛋白体小亚基改变构象引起读码错误，抑制起始嘌呤霉素原、真核核蛋白体大亚基抑制转肽酶，阻碍移位
放线菌酮真核核蛋白体大亚基抑制转肽酶，阻 断延长
红霉素原核核糖体大亚基阻断移位，阻断Pro 合成延长
RNA分子在生物进化中的地位
RNA在生命起源中的地位及其演化过程 生命是自我复制的体系：
三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测能是生命起源中最早的生物大分子。 核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。 由RNA催化产生了蛋白质
DNA代替了RNA的遗传信息功能 DNA双链比RNA单链稳定；
DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。41
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RNA可 现代分子生物学笔记朱玉贤第三版
蛋白质取代了绝大局部RNA酶的功能
蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；
与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反响，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。
蛋白质运转机制 蛋白质运转类别
假设某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，那么属于翻译运转同步机制； 假设蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，那么属于翻译后运转机制。
这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。翻译—运转同步机制 信号序列(signal sequence)：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域， 这个氨基酸序列就被称为信号序列。
信号肽(signalpeptide)：绝大多数越膜蛋白的N端都具有长度大约在 水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。
信号肽的结构特点：
一般带有10-15个疏水氨基酸
1.
13-36个残基之间的以疏
常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸
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在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)
信号序列的根本作用：
通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合 2.通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运SRP&DP
信号识别颗粒 (signalrecognitionpartical，SRP)：是一种核糖核酸蛋白复合体，它的 作用是识别信号序列，并将核糖体引导到内质网上。停靠蛋白(dockingprotein它能够与结合有信号序列的来。
SRP牢牢地结合，使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上
信号肽假说(signalhypothesis)： 提出：&B.Dobborstein(1975) 证明：基因重组实验
核心内容：核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。野生型细胞中，β-半乳糖酶定位于胞质内，麦芽糖结合蛋白定位于胞外，麦芽糖运转蛋白位于外膜内腔。如果把β-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白的氨基端基因片段相连，并以此为模板指导合成杂种蛋白质，就可以通过测定β-半乳糖酶的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。
翻译后运转机制
1.
，DP，又称SRP受体蛋白)：即SRP在内质网膜上的受体蛋白，
线粒体蛋白质的跨膜运输
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叶绿体蛋白质的跨膜运输翻译后运转机制 线粒体蛋白质的跨膜运转
通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。这个过程有如下特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽〔leader
peptide〕
共同组成。②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程；③蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。
前导肽的作用与性质
拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。
前导肽一般具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸〔特别是精氨酸〕含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸〔特别是丝氨酸〕含量较高；有形成两亲〔既有亲水又有疏水局部〕α-螺旋结构的能力。叶绿体蛋白质的跨膜运转
叶绿体定位信号肽一般有两个局部，第一局部决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二局部决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中，蛋白质运转是在翻译后进行的，在运转过程中没有蛋白质的合成。
叶绿体蛋白质运转过程有如下特点：
①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。44
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②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。
③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。核定位蛋白的运转机制
核定位序列〔 NLS—NuclearLocalizationSequence〕NLS可以位于核蛋白的任何部位。
蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子包括核运转因子Importin〕α、β和一个低分子量GTP酶〔Ran〕参与。由上述三个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠RanGTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。细菌同样能通过定位于蛋白质N-端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、外膜、双层膜之间或细胞外等不同部位。
蛋白质的降解
在大肠杆菌中，蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶〔称为 Lon〕来实现的。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一个肽键要消耗两个分子的ATP。
成熟蛋白 N-端的第一个氨基酸〔除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物〕在蛋白的降解中有着举足轻重的影响〔表4-16〕。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3分钟就被降解了。
在真核生物中，蛋白质的降解依赖于泛蛋白〔Ubiquitin〕，该蛋白只有76个氨基酸残基，序列高度保守〔从酵母和人细胞中提取的泛蛋白几乎完全相同！〕，生物细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛蛋白相连。这个过程需有E1、E2、E3三个降解因子参与。
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一旦被降解蛋白与泛蛋白相连接，这个复合体就能被运送到分子量高达1×106的蛋白降解 体系中直到完全降解。 习题
遗传密码的摆动性是指:
A.遗传密码可以互换B.密码的第
3位碱基与反密码的第1位碱基可以不严格互补C.一种密码可
以代表不同的氨基酸D.密码与反密码可任意配对E.不同的氨基酸具有相同密码反密码子IGC可以识别的密码子是:
关于tRNA的表达,以下哪项是错误的:
A.有反密码子,能识别mRNA分子的密码B.由氨基酸臂携带氨基酸C.一种tRNA能携带多种氨基酸D.一种氨基酸可由数种特定的tRNA运载种氨基酸都各有其特定的tRNA
4.真核生物的翻译起始复合物在何处形成?
A.起始密码子 AUG处’末端的帽子结构框框5.合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是: A.脯氨酸B.羟脯氨酸C.丝氨酸D.赖氨酸46
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6.以下哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质生物合成? A.环己酰亚胺(放线菌酮)B.氯霉素C.四环素D.链霉素 嘌呤霉素
7.细胞合成的分泌蛋白质在N端都有一段信号肽 ,这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基:A.大于100到30C.约50D.小于10
8.信号识别颗粒 (signalrecognitionparticle)的作用是:
A.指导RNA剪切B.引导分泌蛋白质跨膜C.指引核糖体大小亚基结合D.直到转录终止
分子生物学研究法现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步使得分子生物学研究在上个世纪中叶开始高速开展。重组DNA技术开展史上的重大事件上世纪分子生物学研究取得的三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质根底问题；第二，50年代提出了
DNA分子的双螺旋结构模型和半保存复制
机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法那么〞和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，说明了遗传信息的流动与表达机制。是遗传物质的实验40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的
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物质根底问题；Hershey和Chase〔1952〕的噬菌体侵染细菌实验2.50年代揭示了 DNA分子的双螺旋结构模型和半保存复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了\"中心法那么\"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。但是：当时由于缺乏有效的别离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与开展。重组DNA技术〔recombination〕重组DNA技术：是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
工具酶：限制性核酸内切酶〔restrictionendonuclease〕DNA连接酶〔DNAligase〕工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件两大技术保证：的体外切割和连接
重组DNA实验中常见的主要工具酶48
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酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子DNA聚合酶I〔大肠杆菌〕按5'到3'方向参加新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原那么合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端〔进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于 DNA链5'或3'末端的磷酸基团
的核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的根底上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。
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重组DNA实验中常见的主要工具酶分子生物学研究的核心技术基因操作〔genemanipulation〕：DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。基因工程〔geneengineering〕：是指在体外将核酸分子接入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内而能持续的繁殖。DNA操作技术核酸的凝胶电泳电泳的根本原理：一种带电粒子在电场中，会以一定的速度移向与它自身带相反电荷的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。核酸的凝胶电泳：糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。v 影响迁移率的四大因素:一、分子物理性质：分子大小：大的迁移快电荷多少：电荷密度大的迁移快构形：闭环(CCC)>单链开环(OC)>线性(L)二、支持介质：
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在电泳中常用无反响活性的稳定的支如琼脂糖和聚丙烯酰胺持介质， 凝胶等， 率与分子的摩擦系数成反比。其中，摩擦系数与凝胶密度相关。
三、电场强度：
其分子的迁移
电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。在低电压时，线状
片段的迁移率与所用电压成正比。但当电压增高时，大分子量
同的，因此琼脂糖凝胶的有效别离范围随电压增大而减小。
速度愈快。
四、缓冲液离子强度：
缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、
DNA
DNA片段迁移率的增大是
不 电场强度愈大，带电颗粒
的泳动
pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。
常用的缓冲
体系有Tris-醋酸〔TAE〕、Tris-硼〕、Tris-磷酸〔TPE〕三种。以TAE最为酸〔TBE 常 用，价格低且其缓冲能力低，需经常更新
脉冲电场凝胶电泳〔pulsed-fieldgelelectrophoresis，简称PFGE〕:
用于别离超大分子量〔有时甚至是整条染色体〕
DNA。
在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成
电场方向与核酸移动方向在另一侧成
45°夹角，而第二个脉
冲的
45°夹角。
应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地别离到分子量高达 107bp的DNA大分
子。
核酸电泳的指示剂:电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈蓝色。溴酚蓝的分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度根本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶电泳中，迁移率比溴酚蓝慢。核酸电泳的染色剂:溴化乙锭〔EB〕是
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一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。溴化乙锭不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合。在适当的染色条件下〔ug/ml〕，荧光强度与DNA片段的大小〔或数量〕成正比。51
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核酸的分子杂交定义：
核酸杂交〔Nucleicacidhybridization〕：是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原那么重新配对形成双链的过程。原理：DNA的变性和复性
在一定的条件〔如适当的温度、有机溶剂存在等〕下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为
DNA的变性〔Denaturation〕。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。DNA的杂交即复性〔Renaturation〕是变性的单链 DNA在一定的条件下〔低于Tm的温度下〕与其互补序列退火形成
双链的过程，因此杂交与Tm值相关。影响杂交的主要因素：温度：一般在低于Tm约15至25度的温度下杂交速率最快。盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过时，对复性速度和Tm值影响不大。甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少℃。常用50%甲酰胺。硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。核酸探针的类型克隆的DNA片段，常用cDNA探针。RNA探针〔Riboprobe〕RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。寡核苷酸探针
可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。52
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4聚合酶链反响扩增产物是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。核酸标记的类型：放射性同位素：
32P,35S,33P目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA
检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。常用核酸杂交技术滤膜杂交固相杂交
原位杂交核酸杂交
液相杂交滤膜杂交：是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。滤膜杂交的根本过程1.核酸探针的制备和标记；2.核酸片段的凝胶电泳别离；3.将凝胶中的核酸片段通过印迹〔blot〕转移到某种固相支持物上；
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4.用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交；5.洗膜〔除去未杂交的游离探针等〕 ；6.检测带标记的杂交分子〔放射自显影或酶联反响〕。常见的几种滤膜杂交1.Southern印迹：指将经过电泳别离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中别离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。
2.Northern印迹：是指
RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反响检
测特定的mRNA分子的含量与大小。根本过程包括：RNA的提取RNA变性电泳RNA转移和固定杂交检测除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外，其余根本与 酶污染。Northernblotting〔诺赛恩RNA印迹技术〕
是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。3
蛋白质杂交技术〔 Westernblotting〕：又称为
Southern印迹同，关键是减少实验中的RNA
immunoblotting，指将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反响的技术。基因探针(probe)：就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基
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因，也可以仅仅是基因的一局部，可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA探针的种类：基因组探针(genomicprobe)；cDNA探针(cDNAprobe)；寡核苷酸探针(人工合成的)。探针的标记：放射性同位素：如32P；非同位素：如生物素、地高辛。理想标记物特点一种理想的标记物，应具备以下几种特性：①高度灵敏性；②标记物与核酸探分子的结合，应绝对不能影响其碱基配对特异性；③应不影响探针分子的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性，杂交体的Tm应无较大的改变；④检测方法具有高度特异性。1、放射性同位素：灵敏度和特异性高、应用广泛；易造成放射性污染、半衰期短。32P、3H和35S2、非放射性同位素：无放射性污染，稳定性好；灵敏度和特异性不太高。半抗原、配体结合生物素、地高辛和荧光素。ProbesynthesisNickTranslation切口平移法RandomPriming随机引物合成法Endlabeling末端标记法细菌转化细菌转化:是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株那么被称为受体菌株。感受态细胞:处于能够接受外源DNA状态的细胞称为。步骤：
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1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温〔0℃〕预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀〔形成原生质球〕。2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞外表的复合物。3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复涂布于选择性培养基中别离转化子。核苷酸序列分析1968年华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略Sanger在它的根底之上开展了快速测定DNA的末端终止法KMullis完善了PCR扩增DNA方法1、Sanger双脱氧链终止法
这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。
由于ddTTP没有3'-OH基团，寡核苷酸链不再继续延长，在本该由dTTP掺入的位置上发生了特异性的链终止效应。2、Maxam-Gilbert化学修饰法
用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生的一组具有各种不同长度的DNA片段的反响混合物，经凝胶电泳别离和放射自显影之后，便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。Gilbert&Maxam的化学修饰法G系统：pH硫酸二甲酯→G→m7G→C8~C9断裂→脱GA+G系统：pH哌啶甲酸〔pidine〕→嘌呤环N质子化→脱嘌呤
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C系统:mol/LNaClC+肼〔hydrazine〕→脱CT+C系统:肼(hydrazine)→翻开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶DNA序列测定的自动化DNA测序步骤与自动化1〕模板制备可自动化2〕定序反响可自动化3〕凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶枯燥，放射自显影。4〕核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化2.自动测序仪Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色引物+T反响系统〔引物
+DNA+dNTP+ddTTP〕黄色引物+G反响系统
〔引物+DNA+dNTP+ddGTP〕绿色引物+A反响系统〔引物+DNA+dNTP+ddATP〕兰色引物+C反响系统〔引物+DNA+dNTP+ddCTP〕3、DNA序列分析的自动化
采用四甲基假设丹明〔tetramethylrhodamine〕作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。电泳过程中，当DNA条带在电场的作用下，经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA在激光的激发下便产生了荧光。4、DNA杂交测序法〔SBH〕
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利用一组序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。基因扩增〔PCR〕PCR的根本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。〔一〕PCR的根本过程1.变性〔Denaturation〕：待扩增的DNA模板加热变性成单链；2.退火〔Annealing〕：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；3.延伸〔Extension〕：在适当条件下，利用 DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。PCR反响的温度循环周期PCR反响的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反响延伸三个步骤完成的。图中设定的反响参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。〔二〕PCR体系中的主要成份1.TaqDNA聚合酶\"它是一种耐热的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性，一般有5’-3外切酶活性，有或无3’-5’外切酶活性〔校对活性〕，无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。2.寡核苷酸引物\"它是决定PCR扩增特异性的关键。PCR中所用引物浓度一般在太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。
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3.MgCl2–Mg2+浓度除影响Taq酶活性外，还影响双链DNA的Tm值，因而影响PCR的特异性和扩增效率。–PCR中的最适 MgCl2浓度一般为 1.5-2.5mM(注意游离 Mg2+浓度还与能结合 Mg2+的化合物如dNTP、EDTA等的浓度有关。4.脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕
–一般采用均衡的 dNTP浓度，4种dNTP各为 200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。5.模板–单、双链 DNA，以及RNA经逆转录合成的cDNA。PCR技术的研究应用1、基因组克隆2、反向PCR与染色体步移3、RT－PCR与RNA分析4、基因的体外诱变与突变的检测5、基因组的比拟研究 (RAPD)5.2.6 DNA与蛋白质相互作用研究5.2.6.1.凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验〔gelretardationassay〕，又叫作DNA迁移率变动试验〔DNAmobilityshiftassay〕，是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。载体指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子称为载体。载体是基因克隆中外源DNA片段的重要运载工具。载体必须具备的条件：
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①复制起点：是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起点才能使其及与其结合的外源基因在适当的宿主细胞中复制繁殖。②有一个或多个筛选标记，如抗药性、显色表型反响等以区别阳性和阴性重组子。③多克隆位点:多种限制性内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。④适当的拷贝数。一般而言，较高的拷贝数不仅利于载体的制备，同时还会使细胞中克隆基因的剂量增加。⑤载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应易于别离，便于提纯。⑥对于表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等DNA调控信号。
载体的类型：质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体等。质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状，如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的根底。
基因组文库与 cDNA文库的构建Ⅰ
cDNA文库的构建一 基因组文库的构建二真核基因组文库\"基因组文库是含有某种生物
体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体，构建基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体\"常用的构建真核生物细胞基因组文库的载体是λ噬菌体和粘性质粒。
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构建基因组文库的步骤1、载体的制备2、基因组
DNA的制备3、载体与基因组
DNA的连接4、体外包装提取物的制备和重组DNA的体外包装5、重组噬菌
体滴度的检测、扩增与保存基因组文库ⅡcDNA文库的构建cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。这样的克隆群体叫做cDNA文库。cDNA文库可直接进行筛选目的基因，由于cDNA中不含内含子，因此所筛选的基因可以直接表达。构建cDNA文库主要包括以下几个步骤：1、mRNA的别离2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA与载体的连接：5、噬菌体的包装、转染和质粒DNA的转化\"如果用质粒
DNA做载体，cDNA与载体连接后可直接转染宿主细胞，建立cDNA文库。如
采用噬菌体为载体，必需经过体外包装，形成噬菌体颗粒，感染宿主菌。RNA提取将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，参加与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。61
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基因的别离与鉴定
基因克隆(genecloning)：又称为重组
DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的 DNA分
子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。根本步骤：用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；外源DNA片段与载体分子的体外连接反响；将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。克隆基因的别离1、应用核酸探针别离克隆目的基因2、应用mRNA差异显示技术别离克隆目的基因3、应用cDNA差示分析法克隆基因4、应用酵母双杂交体系克隆基因5、基因的图位克隆法6、DNA微列阵技术进行基因克隆应用核酸探针别离克隆目的基因把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的别离或筛选。应用核酸探针别离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。此法应用广泛、有效，适用于大规模筛选。应用mRNA差异显示技术别离克隆目的基因看家基因〔house-keepinggene〕，以其组成型表达模式维持细胞的根本代谢活动；发育调控基因〔developmentalregulatedgene〕，以其时空特异性表达模式完成个体的正常生
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长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差异表达〔differentialexpression〕。DDRT-PCR的主要操作步骤如下：〔1〕从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中别离mRNA，并以3‘锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；〔2〕用5'随机引物和某个 3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；3〕用DNA变性测序胶别离扩增产物，X光片曝光后检测差异条带；4〕回收特异性差异条带；5〕用同一引物对扩增已回收的DNA条带；6〕用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；7〕以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。基因的图位克隆法〔Map-basedcloning〕所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并别离出来。根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm〔厘摩〕相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb；拟南芥菜中，1cm≈290kb；小麦中，1cm≈3500kb。本章重点基因组文库和 术原理及应用分子生物学中常用载体的特征核酸杂交原理〔 菌落杂交等〕探针制备方法
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cDNA文库构建过程及应用PCR技
SouthernBlotting,NorthernBlotting,
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DNA与蛋白质相互作用的研究方法SangerDNA测序原理基因别离方法影响电泳迁移率的因素重要概念基因差异表达、基因克隆、cDNA文库、基因工程、基因探针、转化、质粒基因表达的调控本章内容简介一、基因表达调控的根本概念与原理二、乳糖操纵子的调控模式三、色氨酸操纵子的调控模式一、基因表达调控的根本概念与原理1.根本概念：基因表达(geneexpression)：从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，基因表达的实质就是遗传信息的转录和翻译。基因表达的调控
(generegulationorgenecontrol)：对基因表达过程的调节就称为基因表达调控。2.基因表达的时间性及空间性基因表达的时间特异性(temporalspecificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。基因表达的空间特异性〔spatialspecificity〕是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。3.基因表达的方式
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组成性基因表达〔constitutivegeneexpression〕是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。
其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素
的影响。这类基因通常被称为管家基因〔housekeepinggene〕。诱导表达〔induction〕是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。阻遏表达〔repression〕是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。基因表达的生物学意义〔一〕适应环境、维持生长和增殖。〔二〕维持个体发育与分化。基因表达调控主要表现方面转录水平上的调控(transcriptionalregulation)转录水平后的调控 (post-transcriptionalregulation)1〕mRNA加工成熟水平上的调控
(differentialprocessingofRNAtranscript)2〕翻译水平上的调控 (differentialtranslationofmRNA)原核生物基因表达的调控主要发生在转录水平真核生物基因表达的调控可发生在基因表达的各个水平其它影响因素原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmentalfactor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormonelevel)和发育阶段(developmentalstage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。5.基因转录激活调节根本要素：顺式作用元件〔cis-actingelement〕又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。
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在原核生物中，大多数基因表达通过操纵子模型进行调控，其顺式作用元件主要由启动基因、操纵基因和调节基因组成。
在真核生物中，与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子〔promoter〕、增强子enhancer〕和沉默子〔silencer〕。反式作用因子：
反式作用因子〔trans-actingfactor〕又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。原核生物中的反式作用因子主要分为特异因子、激活蛋白和阻遏蛋白；而真核生物中的反式作用因子通常称为转录因子。顺式作用元件与反式作用因子的相互作用：大多数调节蛋白在与DNA结合之前，需先通过蛋白质 -蛋白质相互作用，形成二聚体或多聚体，然后再通过识别特定的顺式作用元件，而与DNA分子结合。这种结合通常是非共价键结合。Ⅰ原核生物转录水平的调控操纵子
弱化子(衰减子)降解物应急反响Ⅱ原核生物的转录后调控操纵子的调控模式根本概述乳糖操纵子的调控模式色氨酸操纵子的调控模式其他操纵子的调控机制操纵子概述
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提出：法国Jacob与Monod〔1961年〕概念
操纵子〔operon〕：指的是一组功能上相关的基因，它是由启动区〔promoter〕、操纵区operator〕和结构基因〔structuralgene〕三局部组成。所谓的操纵子理论是认为在DNA分子上分布有调节基因、启动子、操纵区和一群功能相关的结构基因区。乳糖操纵元典型的操纵子可分为控制区和信息区两局部。控制区由各种调控基因所组成，而信息区那么由假设干结构基因串联在一起构成。概念结构基因(structuralgene)：编码蛋白质的基因。操纵区〔operator〕:是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。调控基因〔regulatorygene〕：是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白〔repressiveprotein〕，其介导的调控方式称为负性调控〔negativeregulation〕；
与操纵子结合后能增强或启动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白〔activatingprotein〕，所介导的调控方式称为正性调控〔positiveregulation〕。乳糖操纵子的调控模式
乳糖操纵子(lactoseoperon)的组成lac体系受调控的证据乳糖操纵子的调控乳糖对lac体系的影响葡萄糖对
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lac体系的影响
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CAP&cAMPlac体系受调控的证据乳糖添加实验同位素示踪乳糖操纵子的本底水平表达在非诱导状态下有少量的lacmRNA合成〔大约每个世代中有1～5个mRNA分子〕，这种合成被称之为本底水平的永久型合成〔backgroundlevelconstitutivesynthesis〕。由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来；这时启动子的障碍被解除，RNA聚合酶开始转录。乳糖操纵子的调控乳糖操纵子的阻遏：B.葡萄糖对
lac操纵子的影响CAP与CAP结合位点CAP的通用名称:
分解代谢基因激活蛋白〔catabolicgeneactivatorprotein〕含有CAP结合位点的操纵子：乳糖操纵元〔lacoperon〕、阿拉伯糖操纵元〔araoperon〕、半乳糖操纵元〔galoperon〕〔见课本206页〕CAP也起类似的正性调控作用。lac操纵子DNA的调控区域(P、O区)氨基酸合成的操纵子
色氨酸操纵子(tryptophaneoperon)的调控模式属于一种负性调控的、可阻遏的操纵子
〔repressibleoperon〕，即这操纵子通常是开放转录的，有效应物〔色氨酸为阻遏剂〕作用时那么阻遏关闭转录。不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。68
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色氨酸操纵子的调控模式trp操纵子的组成trp操纵子的阻遏系统衰减子及其作用前导肽trp操纵子的弱化机制trp操纵子的阻遏系统衰减子及其作用弱化作用(attenuation)：当色氨酸到达一定浓度、但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用，这段序列就称为衰减子或弱化子attenuator〕。在trp操纵元中，对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。前导肽见课本213页色氨酸浓度低——trp操纵元就处于开放状态色氨酸浓度增高——转录减弱Trp操纵子小结其它操纵子的调控机制半乳糖操纵子(galactoseoperon)
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阿拉伯糖操纵子〔arabinoseoperon〕半乳糖操纵子(galactoseoperon)包括3个结构基因：异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactosetransferase,galT)，半乳糖激酶(galactosekinase,galk)特点：
有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录有两个O区，一个在 P区上游-67--53，另一个在结构基因galE内部阿拉伯糖操纵子〔arabinoseoperon〕阿拉伯糖操纵子(arabinoseoperon)，在葡萄糖馈乏时，它能利用阿拉伯糖作为能源。阿拉伯糖操纵子由araB，araA及araD基因组成。
转录后调控〔见课本〕翻译起始的调控稀有密码子对翻译的影响重叠基因对翻译的影响RNA高级结构对翻译的影响魔斑核苷酸水平对翻译的影响本章掌握重点内容基因表达调控的概念、特点和根本原理。
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乳糖操纵子的结构及其组遏蛋白的负性调控和CAP正性调控机理。色氨酸操纵子的转录衰减机制。根本概念：基因表达激活蛋白组遏蛋白顺式作用元件反式作用因子操纵基因衰减子选择题：Lac操纵子的诱导剂是BA．葡萄糖B．别乳糖C．阿拉伯糖O．丝氨酸E．色氨酸.Ara操纵子的诱导剂是
就当前认识，基因表达调控最主要的环节是：A、DNA复制B、RNA转录激活C、RNA转录后加工D、RNA转录后转运E、翻译及翻译后加工〔北京医科大学1999年生化〕3.对自身基因进行转录调控的特异DNA序列是A．顺式作用因子B．反式作用因子C．顺式作用元件D．反式作用元件4.由某一基因表达后，对另一基因进行转录调控的因子是
3.如果操纵子的基因突变缺失A、操纵子将不被转录B、操纵子将继续被转录C、操纵子的阻遏蛋白将继续合成D、将无诱导物E、以上都不是是非题
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调节基因一般都位于operon附近,这种构造有利于调节基因对operon的控制.〔〕〔中科院上海生化所2001〕填空题：操纵子包括_______,__________和__________.〔北师大1999〕选择题分解代谢基因活化蛋白(CAP)对乳糖操纵子表达是A正性调控B正、负性调控C负性调控D无调控作用E可有可无〔1995年北医试题〕简答题：简述乳糖操纵子的正、负调控(2002年中国农科院 )什么是正调控与负调控，试举例说明。(1996年中国农科院 )以乳糖操纵子为例说明什么是基因的表达与阻遏？〔8分〕(1997第四军医大学
Atrp操纵元Blac操纵元Chis操纵元Dthr操纵元是非题：细菌中衰减子的作用方式是用翻译的手段来控制转录.〔〕
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)选择题以下哪个操纵元中没有衰减子序列？
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思考：细菌的Trp操纵子中为什么除需要阻遏体系外还需要弱化子系统？
1.
真核基因表达的调控本章内容简介真核生物基因表达的调节特点真核基因表达调控的环节更
多真核基因的转录与染色质的结构变化相关真核基因表达以正性调控为主其它调控特点：如个体发育复杂；受环境影响较小2.染色质结构影响基因转录结论：紧密的染色质结构阻止基因表达3.真核基因表达以正性调控为主多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。真核基因表达调控的层次DNA和染色体水平上的调控转录水平上转录后RNA加工过程和运送中的调控翻译水平翻译后的控制DNA和染色体水平上的调控
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基因拷贝数的扩增或丧失和基因重排DNA在染色体的位置〔常染色质、异染色质〕染色质结构的变化〔活化〕DNA的碱基修饰基因扩增基因扩增〔geneamplification〕：即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。例如：蛙成熟卵细胞在受精后的发育程中其rRNA基因〔可称为rDNA〕的扩增基因扩增的调控机理至今还不清楚基因扩增的意义基因的扩增能够大幅度提高基因表达产物的量，适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量蛋白质要求有大量核糖体的需要。基因丧失有的生物在个体发育的早期在体细胞中要丧失局部染色体，而在生殖细胞中保持全部的基因组，被丧失的染色体其上的遗传信息可能对体细胞来说没有什么意义，而对生殖细胞的发育也许是不可缺少的。例如：马蛔虫〔Parascarisequoorum〕和小表瘿蚊〔Mayetioledestructor〕的生殖细胞的形成。
基因重排基因重排〔generearrangement〕：即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如：免疫球蛋白的基因基因重排的的生物学意义
这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，
抗体的基因，提高对外界环境的适应性。
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组合变化而产生能编码达
108种不同
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1
染色质的结构变化〔染色质的活化〕组蛋白的作用转录活泼区域对核酸酶敏感度增加DNA
拓扑结构变化DNA碱基修饰变化组蛋白的作用组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合。组蛋白与
DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。转录活
泼区域对核酸酶作敏感度增加活泼进行转录的染色质区域受DNaseⅠ消化常出现100-200bp的DNA片段，且长短不均一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseⅠ高敏感点
〔hypersensitivesite〕。高敏感点常出现在转录基因的5‘侧区、3‘末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近，分析该区域核小体的结构发生变化，有利于调控蛋白的结合而促进转录。染色质的活化DNA拓扑结构变化天然双链
DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活泼转录时，RNA聚合酶转
录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；而负性超螺旋那么有利于核小体的再形成。DNA甲基化与基因表达DNA甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶
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N6-甲基腺嘌呤7-甲基鸟嘌呤4在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。DNA甲基化与基因表达
真核生物基因组DNA的甲基化(Methylation)哺乳动物基因组中5%的C为甲基化(mC)，mC主要存在于CpG二核苷酸中．CG岛(CGislands):CpG二核苷酸序列常成簇聚集并零散地分布于人基因组中，形成CpG岛。CpG岛常与基因相连
(可作为寻找基因的标记)。DNA甲基化和 CG岛
由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丧失，所以，高等真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CGislands，大多位于转录单元的5'区。DNA甲基化与基因表达基因甲基化状态：1、高度甲基化：基因为持续失活(如女性的一条X染色体；2、诱导去甲基化：如组织或发育阶段特异性表达基因；3、持续低水平甲基化：具有转录活性(如持家基因)。简答题
简述真核细胞基因组结构特点及基因表达
调控方式。
〔第四军医大分子生物学〕
〔10分〕
真核生物的基因表达调控可以在哪些水平上发生？何谓转录前调控，它有哪几种主要方式，
各发生在什么发育时期？试举例说明之。
〔中科院2001细胞学〕76
〔10分〕
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选择题真核生物DNA中大约有百分之2-7的胞嘧啶存在甲基化修饰，绝大多数甲基化发生——二核苷酸对上A.CCB.CTC.CGD.CA〔中科院上海生化所98〕非洲爪蟾体细胞中rDNA拷贝数约有500个，而在卵母细胞中的拷贝数约增加了———倍，可以用来转录合成卵裂所需要的ribosome。〔中科院上海生化所2001〕判断题活泼转录的基因均位于常染色质中，处于异染色质中的基因通常不表达。转录水平的调控基因转录的顺式调控元件基因转录的反式作用因子基因转录的根本条件基因转录的顺式调控元件顺式调控元件(cis-regulating element)是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因．基因转录的顺式调控元件正调控元件：启动子(promoter)
增强子(enhancer)b.负调控元件—寂静子 (silencer)77
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负调控元件是能抑制基因表达的序列．c.其它顺式调控元件：应答元件转座元件
启动子(promoter)真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有假设干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp。启动子中的元件核心启动子元件
(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。
上游启动子元件(upstreampromoterelements)包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。增强子增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由假设干组件构成，其根本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。寂静子
最早在酵母中 T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中发现证实。寂静子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。增强子与寂静子概念的相对性应答元件〔responseelement〕定义：现代分子生物学上把能与某个〔类〕专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件。
功能：它们与细胞内高度专一的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。最常见的应答元件：热激应答元件〔heatshockresponseelement,HSE〕
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糖皮质应答元件〔glucocorticoidresponseelement，GRE〕金属应答元件〔metalresponseelement,MRE〕铁应答元件〔IRE〕基因转录的反式作用因子
转录水平的调控主要是通过与多种DNA元件结合的蛋白因子来实现．反式作用因子(trans-actingfactor)是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因转录效率的一组蛋白质．
反式作用因子对基因表达的调控可正(激话)可负(阻遏)．补充：反式作用及反式作用元件调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用〔trans-action〕，调控基因就属于反式作用元件〔trans-actingelement〕，其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子〔trans-actingfactor〕。反式作用因子的结构区域DNA结合域〔DNAbindingdomain〕，多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成。转录激活域〔activatingdomain〕，常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见；连接区，即连接上两个结构域的局部。a.反式作用因子的
DNA结构域
结构域(domain):是指蛋白质中可以具有独立的超二级结构的局部。通常由一个基因外显子编码，并可具有特定的功能。在较大的蛋白质中，多个结构域间可通过较短的多肽柔性区互相联接．基序(motif)：一般指构成任何一种特征序列的根本结构．作为结构域中的亚单元，其功能是表达结构域的多种生物学作用．1．DNA结合结构域基序
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a.Helix-turn-helix〔螺旋-转角-螺旋〕。是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA序列相识别的氨基酸。b.Zincfinger〔锌指〕。长约30个aa，其中4个氨基酸〔Cys或2个Cys，两个His〕与一个Zinc原子相结合。与Zinc结合后锌指结构较稳定。
c.Homeodomain〔同源域〕，最早来自控制躯体发育的基因，长约60个氨基酸，其中的DNA结合区与helix-turn-helix motif相似，人们把该 DNA序列称为 homeobox。主要与
DNA大沟相结合。
d.Leucinezippers〔亮氨酸拉链〕是亲脂性〔amphipathic〕的α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔6个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸〔Lys〕和精氨酸〔Arg〕组成DNA结合区。几种常见基序E螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序
由2个α螺旋间隔一个非螺旋的环(loop)组成．如原癌基因产物C-myc及其结合蛋白Max．特异性基因转录的根本条件：①启动子(特别是核心启动子
)②转录模板(转录起始点〔+1〕
---终止点)③RNAPolⅡ④普通转录因子(GTFs)真核细胞的三种RNA聚合酶转录因子与普通转录因子以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子〔transcriptionfactors，TF〕。在真核基因转录中,一些转录因子是
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RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的，并且可以维持根底水平
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的转录，因此称为根底转录因子或普通转录因子(generaltranscriptionfactor)与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用RNA聚合酶Ⅱ的根本转录因子3.转录后加工
在细胞核内对基因产物(mRNA前体)进行各种修饰、剪接和编辑，使编码蛋白质的外显子局部连接成为一个连续的开放读框(openreadingframe，ORF)的过程称为转录后加工．4.翻译水平调控翻译起始因子(IF)的调节：可逆磷酸化的作用．1．eIF-4F的磷酸化激活蛋白质的合成．eIF-2的磷酸化引起翻译起始受阻，降低蛋白质的生物合成水平mRNA结构与翻译控制(一)5’-UTR结构1、mRNA5’端m7G帽有增强翻译水平的作用．2、“上游AUG密码子〞(位于起始AUG上游的其他AUG密码子)的存在往往抑制下游开放读框的翻译效率．3、起始AUG旁侧序列对翻译效率的影响．Kozak序列：GCCAUGG(二)3’-UTR结构1．poly(A)尾增加翻译效率2．富含UA序列抑制翻译。mRNA稳定性与翻译控制mRNA稳定性主要取决于
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3’—UTR结构
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1〕poly(A)尾增加mRNA稳定性，2〕3’-UTR中UA序列导致mRNA不稳定．翻译后修饰1 侧链的共价修饰：乙酰化、磷酸化、糖基化〔N-、O-〕2
蛋白质前体的切割和成熟。
氨基酸
Proprotein→protein.例：胰岛素的成熟。蛋白质的磷酸化反响指通过酶促反响把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶
对外界信号具有级联放大作用.
\"活性\"。
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反响。本章重点掌握内容真核基因表达调控特点DNA的甲基化与基因表达真核基因调控顺式作用元件和反式作用因子的概念及种类真核转录因子的结构区域根本概念：基因扩增基因重排启动子增强子寂静子应答元件motifHomeodomainHTHZincfingerLeucine-ZipperHLH
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