该试验适用于检查药典要求无菌的药物、制剂产品或其他物品是否无菌的一种方法。然而，合格的结果仅表明在该试验条件下样品中未发现微生物污染。
预防微生物污染的措施无菌检查应在无菌条件下进行。为了达到该条件，试验环境必须达到无菌检查的要求。防止污染采取的措施应确保不会影响供试品中微生物的检出。通过对工作区域进行适当取样并进行适当控制，来定期监控进行试验的工作条件。
培养基和培养温度用于试验的培养基可按如下所述制备，或可使用等效的商业培养基，只要它们符合生长促进试验的要求。
以下培养基已被证实适用于无菌试验。硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养。但其也可用于需氧菌培养。大豆-酪蛋白培养基适用于真菌和需氧菌的培养。
硫乙醇酸盐流体培养基
成分L-胱氨酸氯化钠水合葡萄糖/无水
琼脂
酵母提取物(水溶性)胰酶消化酪蛋白胨硫乙醇酸钠或硫乙醇酸
新配制的刃天青钠溶液(1:1000)
纯水
注：灭菌后的pH值:7.1±0.2。
重量0.5g2.5g5.5/5.0g0.75g5.0g15.0g0.5g0.3mL1.0mL1000mL
将L-胱氨酸、琼脂、氯化钠、葡萄糖、酵母提取物和酪蛋白的胰腺消化物与纯水混合，并加热至溶解。将硫乙醇酸钠或硫乙醇酸溶解于该溶液，如果需要可加入1mol/L氢氧化钠溶液，以便在灭菌后该溶液呈pH值7.1±0.2。如需要过滤，再次加热该溶液但不得煮沸，并趁热以湿润滤纸将该溶液过滤。加入刃天青钠溶液，混匀，并将该培养基置于适当容器中，该容器应为培养基提供特定的面积/深度比，以使在培养期结束后能明确显示氧气摄入的变色部分不超过培养基的上半部分。使用经过验证的工艺进行灭菌。如果需要贮存该培养基，应将其置于无菌、气密容器中，在2～25℃贮藏。如果超过三分之一的培养基已经呈粉红色，可以用以下方法恢复该培养基功能，但每批培养基仅能恢复一次：在水浴锅中或者自由流动蒸汽中加热该容器，直至粉色消失，并迅速放凉，须小心防止非无菌空气进入到容器中。灭菌后培
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养基存放时间超过验证期限时，不得使用。
硫乙醇酸盐流体培养基应在30～35℃条件下进行培养。含有汞制剂防腐剂的产品不能使用膜过滤方法检测。经需气菌、厌氧菌、真菌促生长试验验证，在20～25℃培养时，大豆酪蛋白消化培养基可以替代硫乙醇酸盐流体培养基。经合理授权，配制的与硫乙醇酸盐流体培养基成分相同，但省略了琼脂和刃天青溶液的培养基，可以替代硫乙醇酸盐流体培养基使用。按上述方法灭菌，灭菌后pH值为pH：7.1±0.2。使用前用水浴加热，置于30～35℃厌氧条件下培养。
大豆-酪蛋白消化培养基
成分
酪蛋白胰腺消化物大豆粉木瓜蛋白酶消化物
氯化钠磷酸氢二钾水合葡萄糖/无水
纯水注：灭菌后的pH值:7.3±0.2
重量17.0g3.0g5.0g2.5g2.5/2.3g1000mL将固体物质置于纯化水中，轻微加热使其溶解。溶液放凉至室温，并用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值，使其灭菌后pH值为7.1±0.2。如需要使之澄清，则过滤，分装入适合的容器，并用经过验证的程序灭菌。如果不立刻使用，则保存在2～25℃无菌且密闭良好的容器中。灭菌后培养基存放时间超过验证期限时，不得使用。
大豆-酪蛋白培养基将在22.5±2.5℃条件下培养。
所用的培养基应符合以下试验，这些试验在待检产品试验之前完成或同时进行。无菌：将部分培养基培养14天，应不得出现微生物生长。
需氧菌、厌氧菌和真菌的生长促进试验
测试每批配制好的培养基和每批的由脱水培养基或配方制备的培养基。使用的微生物菌株见表2.6.1-1。
接种少量（不超过100cfu）下列的微生物菌液至部分硫乙醇酸盐流体培养基中，下列每种微生物均分别接种于单独培养基中：生孢梭菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。
接种少量（不超过100cfu）下列的微生物菌液至部分大豆-酪蛋白胨培养基中，下列每种微生物均分别接种于单独培养基中：巴西曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。细菌培养时间不超过3天，真菌培养时间不超过5天。
采用适宜的菌种保藏技术，以确保用于接种的微生物的传代次数不超过5代。
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表2.6.1-1适用于生长促进试验和方法适用性试验的试验微生物菌株
需氧细菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌厌氧细菌生孢梭菌真菌白色念珠菌巴西曲霉ATCC10231，IP48.72，NCPF3179，NBRC1594ATCC16404，IP1431.83，IMI149007，NBRC9455ATCC19404，CIP79.3，NCTC532，ATCC11437，NBRC14293ATCC6538，CIP4.83，NCTC10788，NCIMB9518，NBRC13276ATCC6633，CIP52.62，NCIMB8054，NBRC3134ATCC9027，NCIMB8626，CIP82.118，NBRC13275如果出现肉眼可见的微生物生长，则培养基是合适的。
方法适用性测试除以下修改外，使用完全相同的方法，按照待检产品无菌检验要求进行检验。
薄膜过滤法：将待测容器的内容物转移到滤膜上后，在最后一次冲洗液中加入少量(不超过100cfu)的接种菌液。
直接接种法：将一个或多个待测容器的内容物(用于兽医用的肠线和其他外科缝合线:若干股线)转移至培养基后，向培养基中加入少量(不超过100cfu)的接种菌液。
在这两种情况下，使用与上述需氧菌、厌氧菌和真菌生长促进试验中所述相同的菌株。同时设置生长促进试验作为阳性对照。在相应培养基中培养时间不超过5天。
如果在培养后获得清晰可见的微生物生长，生长形态与未接种样品的对照试验类似，则说明该产品在此试验条件下没有抑菌作用，或者其抑菌作用已被消除。此时无菌试验可按该方法和条件进行，无需进一步修改。
如果在待测产品存在的条件下观察不到肉眼可见的混浊，则该产品在该试验条件下不能消除供试品的抑菌作用。需要修改实验条件消除产品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。
需进行方法适用性检验的情况：a）当新产品进行无菌试验时；b）每当试验条件发生变化时。
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方法适用性可与待检产品的无菌检查同时进行。
待检产品的无菌检查无菌检查可使用薄膜过滤法或直接接种法，应设置适宜的阴性对照。只要产品性质允许，应采用薄膜过滤法，也就是说，对于可过滤的水溶性制剂、酒精或油性制剂，以及易混合或溶解于水或或油性溶剂的制剂，前提是该试验条件下没有抑菌作用。
薄膜过滤法：使用标称孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器，该过滤器经证实能够有效截留微生物。例如，硝酸纤维素过滤器用于水性、油性和低浓度烯醇溶液；醋酸纤维素过滤器用于高浓度醇溶液。某些产品(如抗生素)可能需要特殊的过滤器。
以下涉及的方法均使用直径约50mm的滤膜。如果使用不同直径的过滤器，应相应调整稀释液和洗涤液的体积。过滤装置和滤膜都应经过适当的方式灭菌。
该过滤器应满足待检溶液在无菌条件下加入并过滤的要求，允许无菌条件下取下滤膜并转移到培养基上，或者满足将培养基加入至该设备后进行培养的要求。
水溶性液体
如果合适，将少量合适的无菌稀释剂，如1g/L的中性肉溶液或pH值7.1±0.2的酪蛋白蛋白胨溶液，转移到过滤器薄膜上。稀释剂可含有合适的中和物质和/或灭活物质，例如在抗生素的存在情况下。
如有必要，在用选定的无菌稀释剂稀释至方法适用性试验中所用的体积后，将待测容器中的内容物转移至膜上，立即过滤。但使用的待测产品的量不得少于表2.6.1-2中规定的量。如果产品具有抗菌活性，则至少冲洗滤膜3次，每次冲洗量按方法适用性试验中选定的无菌稀释剂体积。冲洗周期不得超过5次100mL，即使在方法适用性中，已经证明该冲洗周期不能完全消除抗菌活性。将整个滤膜转移到培养基中，或在无菌条件下将其切成两等份，并将每一半转移到两种合适的培养基中。使用与方法适用性试验中相同用量的培养基。或者，将培养基转移到带有滤膜的滤器中。该培养基培养不少于14天。
可溶性固体
对于每种培养基，使用不少于表2.6.1-2中规定数量的产品溶于适当溶剂中，如所述溶剂制备、注射用水、生理盐水或1g/L中性肉溶液或酪蛋白蛋白胨，并选用适合所选溶剂的滤膜，按照上述水溶性液体要求进行试验。
油和油性溶液
对于每种培养基，使用不少于表2.6.1-2中规定数量的产品。粘性较低的油溶液可以不经稀
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释通过干燥滤膜过滤。粘性油质必要时可以用合适的无菌稀释剂进行稀释，如在该试验条件下不具有抗菌活性的肉豆蔻酸异丙酯。允许油质通过其自身重量渗透膜，逐渐加压或抽吸进行过滤。使用合适的无菌冲洗液冲洗滤膜，每次过滤大约100mL，至少冲洗3次，如1g/L的中性肉溶液或酪蛋白蛋白胨溶液通过方法适用性试验确定乳化剂的适宜浓度，例如浓度为10g/L的聚山梨醇酯80。转移滤膜到培养基上，或者参照水溶性液体的步骤要求进行，培养基按上述规定条件进行培养。
油膏和乳膏
在每种培养基中使用不少于表2.6.1-2中规定数量的产品。脂肪状油膏和油包水型乳剂可在肉豆蔻酸异丙酯中稀释至1%，必要时可加热，但不超过40℃。在特殊情况下，加热温度可适当增加，但不超过44℃。尽快过滤，并按照上述油和油性溶液的要求进行处理。
表2.6.1-2每种介质的最小用量
每个容器的数量
液体少于1mL1~40mL
大于40mL，不大于100mL大于100mL液体抗生素
待悬浮或乳化的不溶性制剂、乳膏和软膏固体少于50mg50mg或以上，但不大于300mg300mg~5g大于5g
兽医用肠线和其他外科缝合线
每个包装的全部内容
每个包装内容物的一半，但不少于50mg150mg500mg一股线的3段(每段30cm长)每个包装的全部内容
每个包装内容物的一半，但不少于1mL20mL
容器内容物的10%，但不少于20mL1mL
每个包装少于200mg的内容物最少接种量(除另有规定和授权外)
培养基的直接接种
将表2.6.1-2中规定的待检样品的量直接转移到培养基中，除另有规定外，接种量不超过培养基体积的10%。
如果待检产品具有抗菌活性，则用合适的中和剂或用足量培养基稀释消除抗菌活性后进行试验。当有待检产品体积较大时，考虑后续稀释的需要，可优选制备浓缩培养基。在适当的情况下，可以将浓缩培养基直接添加装有产品的容器中。
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油性液体
使用已添加适当乳化剂的培养基，其浓度在方法适用性试验中证明适用于该试验，例如浓度为10g/L的聚山梨醇酯80。
油膏和乳膏
通过用选定的乳化剂在合适的无菌稀释剂中稀释至约1:10，例如1g/L的中性肉溶液或酪蛋白蛋白胨溶液，以含有乳化剂的稀释液来制备产品。将稀释的产品转移到不含乳化剂的培养基中。
接种后的培养基培养不少于14天。定期观察培养情况。每天轻轻摇动含有油性产品的培养基。然而，当硫乙醇酸盐流体培养基用于检测厌氧微生物时，尽量减少摇动，以维持厌氧条件。
兽医用肠线和其他外科缝合线
在每种培养基中使用不少于表2.6.1-2中规定数量的产品。在无菌操作下打开密封包装，从该线前端、中间、末端分别取约每段30cm的产品进行试验，每种培养基均接种该股线取的3个部分产品。使用适量的培养基足以充分覆盖待测产品(20mL至150mL)。
结果的观察和判断在培养期间和结束时，都要检查培养基是否有肉眼可见的微生物生长。如果待检产品材料使培养基变浑浊，导致无法通过肉眼观察确定是否有微生物生长，则在培养14天后，将部分培养基(每个不少于1mL)转移到含有相同新鲜培养基中，然后将原始容器和转移容器培养不少于4天。
如果没有发现微生物生长的迹象，则待检产品符合无菌检查的要求。如果发现微生物生长，除非有充分证据证实此次试验无效或微生物污染与该产品无关，否则判断待检产品不符合无菌检验。当满足以下一个或多个条件时，认为试验无效:
a）该无菌检查试验设施的微生物监控结果不符合要求。b）通过实验回顾发现实验过程中有可能导致实验过程污染。c）在阴性对照中发现微生物生长。
d）从试验中分离出的微生物的经过鉴别后，确定该（或这些）微生物的生长与实验材料有关和/或与无菌操作不当有关。
如果试验证明无效，则使用与原始试验中相同数量的产品重复进行试验。如果在重复试验中没有发现微生物生长，则被检产品符合无菌试验的要求。如果在重复试验中发现微生物
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生长，则被检产品不符合无菌试验要求。
无菌检查在注射制剂、眼用制剂和其他无菌非注射用制剂的应用当使用薄膜过滤法时，尽可能使用容器的全部内容物，但不少于表2.6.1-2规定的检验量，必要时用合适的无菌溶液稀释至约100mL，例如1g/L的中性肉溶液或酪蛋白蛋白胨溶液。
当使用直接接种法时，按表2.6.1-2要求的检验量，除非另有规定或授权，可用一份待检产品的不同部份同时用于细菌、真菌的无菌试验。当单个容器中的体积或数量不足以进行试验时，使用2个或多个容器中的内容物来接种不同的培养基。待检产品最小检验量待检产品的最小检验与产品的批量大小有关，详见表2.6.1-3。
表2.6.1-3相对于该批次中的物品数量，待测物品的最小数量批次产品数量*
注射剂
不多于100个容器
多于100个但不多于500个容器多于500个容器眼科和其他非注射制剂不超过200个容器多于200个容器
如果该产品以单剂量容器的形式存在，则应用上述注射剂方案
兽医用羊肠线和其他外科缝合线不超过100件
超过100件，但不超过500件超过500件固体原料最多4个容器
多于4个容器，但不多于50个容器超过50个容器
每个容器
20%或4个容器，取较多者2%或10个容器，取较多者2%或5包，取较多者，最多20包10%或4件物品，取较多者10个
2%或20件物品，取较少者5%或2个容器，取较多者10个容器
10%或4个容器，取较多者10个容器
2%或20个容器，取较少者
最小样品数量(除另有规定和授权外)
注：*如果批次大小未知，请使用规定的最大项目数。
**如果一个容器中的内容物足够接种2种培养基，此表格给出的容器数量为用于全部2种培养基的数量。
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