分子克隆技术实验讲义
黑龙江大学生命科学学院
2016年3月
甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定
一、实验目的
1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。2、学习和掌握质粒、3、学习和掌握4、学习和掌握5、学习和掌握
T载体的特点。
TA克隆的连接体系及操作要点。XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。8、学习并掌握碱法小量制备质粒二、相关知识
.
DNA的原理及操作步骤。
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（一）T载体的制备
pMD18-T Vector是一种高效克隆而成。在pΜC 18多克隆位点处的酶切反应后，再左两侧的
PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由
pΜC 18载体改建
EcoRⅤ进行
XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用
3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）
把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因目的基因重组于载体分子中，
“装进”载体的过程，即
DNA的重新组合。为了将一般采用内切酶法将载体
需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，
DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入体，如专门用于克隆
PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
DNA片段的专用载
相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。（三）大肠杆菌感受态细胞的制备
外源基因与载体在体外连接成重组体
DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大
量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（
competent cell）是经过一定方法处理后，具有
DNA分子。
（4）转化定
接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的
相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定
将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。个目的，一是大量产生重组
（3）感受态细胞定义及其功能；
把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两
DNA分子往往只有纳克级的量，不易
DNA分子，在完成连接反应后，重组
操作和进行下一步的分析，若把重组中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组分子进行纯化，在构建重组
DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆DNA分子，这样重组
DNA分子的量就多了；二是对重组
DNA
DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成
以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组上的DNA片段、自身环化的
DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接
DNA片段的重组
DNA分子，未连接上的载体和
DNA分子和连接上污染
DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒
.
DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个
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克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组分子。
所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（
DNA
DNA分子的转化细胞。
DNA片
DNA分子和连接上污染
screening）。根据载体体
系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为以进一步分为免疫学方法、
相关知识点：
①转化（transformation）②转染
(transinjection)
质粒（plasmid）噬菌体（phage）
DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可
mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。
③显影注射
（1）导入的方法
④电转化⑤基因枪⑥脂质体介导法
⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法
（2）重组子：
转化子
2.5kv geneblaster
（3）重组反应体系中的成分：①②③④⑤⑥（4）筛选的方法
DNA鉴定筛选法：定位、测序
①直接筛选法
选择性载体筛选法：分子杂交筛选法：
λph包裹、抗药性ISH、Southern Blot 免疫化学
免疫学方法
②间接筛选法
mRNA翻译检测法
（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）
原核生物没有真正的细胞核，
DNA一般位于一个类似
“核”的结构——称为类核体上（因为不是一个
DNA，含有1 400
酶免疫检测
α-互补
完整的细胞核）。E.coli的遗传物质主要是染色体个以上的基因，另外还有一些质粒
1、质粒的概念质粒是细菌（如
.
DNA ，E.coli的染色体为双股环状
DNA。
E.coli）染色体外的小型环状双链DNA分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所
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必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒的意义
（1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的
DNA分子，正好处于生命与非生
命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。
（2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。
3、质粒的分类
不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少，为严密型质粒和松弛型质粒。
（1）严密型质粒（stringent plasmid）：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒，其的复制与宿主染色体
DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有
1-2个拷贝。
DNA
Rownd（1969）把质粒分
（2）松驰型质粒（relaxed plasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为质合成被抑制，细胞染色体
DNA和严密型质粒
10～200个。当向培养基中加入氯霉素时，细胞的蛋白DNA的复制停止，松驰型质粒
DNA的复制继续进行。
松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。
相关知识点：（1）质粒的分类：
①与宿主相关程度：严密型质粒（
stringent plasmid）、松弛型质粒（relaxed）
②是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒③带有特殊用途的基因：生殖质粒（蛋白质）、降解质粒、致病质粒（
Ti）
CsCl、试剂盒、碱裂解法；
OL S
F质粒）、抗性质粒（R-质粒）、col质粒（编码杀死其他细菌的
（2）质粒的提取方法：煮沸法、（3）质粒的构型：
①SC构型：cccDNA (covalently closed circle DNA) ②OC构型：ocDNA (open circle DNA) ③L构型：L-DNA (linearDNA)
.
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三、实验原理（一）T载体的制备
XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：
5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5
其中阴影部分为XcmⅠ的识别序列，“^”为XcmⅠ的切割位点，其识别序列中间的对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用用了XcmⅠ的识别序列的特点，引物的
9个任意核苷酸（N）
XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体，本实验利
3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：
- 3′
Primer1：5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT
Primer2：3′- TCTCTAAGGTATGC^ATATGACCCGC- 5′引物中“^为”XcmⅠ的切割位点，当载体形式完全一样的
3′-T粘性末端。
XcmⅠ对PCR得到的线性片段进行酶切的时候，便会产生一个与
T
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）
1988年，Clarke发现所有的PCR产物都在TaqDNA聚合酶的作用下在腺苷酸，因为
TaqDNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链
3′端附加上了一个
3′突出的
DNA末端加上一个单一3′胸腺嘧啶（dTTP）形成T-A
的3′突出的dATP，利用TaqDNA聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加克隆系统，即可直接对
PCR产物进行有效的克隆，这样的载体称为
T-载体。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备
.
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大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收
20世纪70年代初期发展起来的，当时人们发现如果把E.coli
DNA分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用
RbCl）也很有效。尽管对这
50 mmol/L的氯化钙（CaCl2）溶液来制备感受态细胞。其他的盐（如氯化铷
一处理的确切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解，让外源
DNA分子通过质膜进入；另一种认为
DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处
它们就能稳定地
于感受态时表面形成了一种可接受摄取外源DNA分子了。
DNA的酶位点。一旦细胞被处理制备成感受态细胞，
（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定
转化是使重组体
DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。
一般认为DNA分子在转化过程中将
经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链为转入阶段，双链
DNA分子将吸附于感受态细胞的表面；第二个阶段
DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶
DNA；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子
段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状一起复制。
有些株系的
E.coli尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很方便，但有的质粒还是采用
pΜC 8载体为例，它除了含有氨苄青霉抗性基因以外，还含有
半乳糖苷酶参与的将乳糖分解成葡萄糖和半
E.coli带有修饰过的
LacZ基
pΜC
了其他基因进行筛选，效果同样不错。以
一个称为LacZˊ的基因。该基因编码β-半乳糖苷酶的一部分。乳糖的生化过程，本来是由
E.coli染色体上的LacZ基因编码。有些株系的
因（即缺少LacZˊ的LacZ基因），只编码β-半乳糖苷酶的α-肽。这些株系的E.coli细胞只在有吸收了像
8这样带有LacZˊ基因的质粒分子的情况下才能够合成完整的β-半乳糖苷酶。因此在筛选pΜC 8的重组子
β-半乳糖苷酶的活性来选择重组
时，先将转化子涂布于含有氨苄霉素的培养基上培养，然后再通过检测子，既能抗氨苄霉素，又能合成常直接地检测
β-半乳糖苷酶的细胞就是重组子细胞。现代化学的发展给我们提供了非
这种方法涉及一种乳糖的类似物
——5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃
X-gal
β-半乳糖苷酶活性的方法，
半乳糖苷（5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL-β-D-galactopyranoside），因为它的英文名太长，所以人们就用来代替它的长名。
β-半乳糖苷酶可以将
X-gal 分解成一种深蓝色的产物，这个反应是很灵敏的。当带有
氨苄青霉素的培养基中加有那些能合成完整
X-gal及一种β-半乳糖苷酶的诱导物（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）时，
X-gal而变成深蓝色，而重组子因LacZˊ基因
β-半乳糖苷酶的未重组克隆就会因它能酶解
被破坏不能合成完整的
E.coli↓
修饰的LacZ基因（缺少LacZ′基因）
↓
.
β-半乳糖苷酶而呈白色，蓝白分明，重组子的筛选也已泾渭分明。
修饰过的pUC系列质粒
↓多LacZ基因
↓
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β-半乳糖苷酶C末端ω-肽β-半乳糖苷酶N末端α-肽
↓
完整的β-半乳糖苷酶
↓ X-gal/IPTG 深蓝色
（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）
碱裂解法是一种用得最广泛的制备质粒法抽提质粒
DNA是基于染色体
DNA的方法，是当今分子生物学研究中的常规作法。
碱变性
DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，当细胞在有
RNA、DNA发生变性，加入中
NaOH和SDS（十六烷基磺酸钠）的溶液Ⅱ中裂解时，蛋白质与染色体、和液醋酸钾溶液Ⅲ后，溶液变成中性，质粒离心，蛋白质与染色体
DNA复性，质粒DNA以原来的构型保存在原溶液中，进行
DNA则留在上清液中。
DNA提取，比较方便和省时，该法
DNA随细胞碎片沉淀下来，质粒
这种方法主要用于从小量培养物或同时从许多细胞克隆中进行提取的DNA纯度较高，不需进一步纯化即可满足测序、
（1）SolutionⅠ：破坏细胞壁。
（2）SolutionⅡ：高pH值，SDS使宿主染色体（3）SolutionⅢ：乙酸钾中和质粒
合物。
四、实验过程（一）T载体的制备
1、pYCQ1载体的质粒提取（1）挑取含有质粒
pBI121的大肠杆菌单菌落，接种于
12-14h）。
PCR等。
DNA和蛋白质变性。
DNA不复性，仍和变形蛋白质缠绕成大的复
DNA复性、染色体
50mL LB（含Amp抗生素60μg/mL）液体培
养基中，37℃，180 r/min振荡培养过夜（约
（2）取适量培养物加入离心管中，室温
8 000 r/min离心4 min，弃上清，收集菌体。
（3）将100μＬ预冷的溶液I加入到离心管中，在旋涡混合器上剧烈振荡，使菌体分散混匀。
（4）加入溶液II（1%SDS 100μＬ，0.2 mol/L NaOH 100μＬ），快速颠倒10次混匀（不要剧烈振荡）。（5）加入150μＬ预冷的溶液III，将管缓慢颠倒数次混匀并冰上放置心4min。
（6）少量多次吸取上清转移至新管，小心不要引入白色的蛋白质污染。（7）加入400μＬ预冷的苯酚氯仿异戊醇心5min。
（8）小心移出上清于一新
.
5min后，4℃12 000 r/min，离
（25：24：1），上下颠倒，去除蛋白质，4℃12 000 r/min 离
1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后冰置10min，以沉淀
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质粒DNA 。4℃12 000 r/min离心3min。
（9）弃上清，用
200μＬ预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心3min，去上清，滤纸吸干多余
液体，固体在室温下放置无乙醇味。
（10）获得的质粒载体pYCQ1沉淀溶于25μLddH2O，-20℃保存备用。
2、PCR扩增反应
取一支0.2mLPCR管，冰上建立
PCR反应体系，PCR反应液按表1进行配制。
表1 pYCQ1载体的PCR反应体系成
分
用
量
Ex Taq Buffer
2.5μＬddH2O
17.5μＬdNTP（2.5mmol/L）1.5μＬP1（10 μmol/L）1.0μＬP2（10 μmol/L）1.0μＬ模板（质粒载体
pYCQ1）
1.0μＬEx Taq酶0.5μＬTotal Volume
25μＬ
扩增程序：94℃2min；94℃0.5min，50~60℃0.5min，72℃1.5min，30个循环；72℃4min，保存。
3、XcmI单酶切PCR产物
取一支0.2mLPCR管，冰上建立酶切反应体系，酶切反应液按表
2进行配制。
表2 XcmⅠ酶切反应体系
成
分
用量
XcmⅠBuffer 2.5μＬPCR扩增产物
16.5μＬXcmⅠ0.5μＬddH2O 5.5μＬTotal Volume
25μＬ
加封口膜后才可放入水浴锅中，
37℃水浴2.5h。酶切后，65℃水浴10min终止酶切反应。
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）
4、与PCR产物连接
取一支0.2mLPCR管，冰上建立连接反应体系，连接反应液按表
3进行配制，16℃水浴1h。
表3 连接反应体系
.
4℃
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成分用量
10×T4 DNA Ligase Buffer
ddH2O BvM14-glyI基因载体（XcmⅠ酶切产物）
T4 DNA Ligase Total Volume
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备
5、DH5α感受态细胞的制备（1）从37℃培养的平板中挑取一个振荡过夜。
DH5α单菌落，接种于
1.0μＬ2.0μＬ5.0μＬ1.0μＬ1.0μＬ10μＬ
50mL LB液体培养基中，37℃180 r/min
（2）次日按1%的量（500μＬ）接种于50mL LB液体培养基中，37℃180 r/min振荡培养1h 40min。（3）将菌液分装于
10mL离心管中，4 000 r/min 4℃离心5min，去上清，收集菌体，加入
30min。
1mL预冷的0.1 mol/LCaCI2，轻轻悬浮沉淀。200μＬ的感受态细胞，4℃保存备用。
5mL预冷
的0.lmol/L CaCl2。轻轻悬浮沉淀，置冰上
（4）4 000 r/min离心5min，去上清，加入（5）进行分装，每一个
1.5mL离心管中加约
（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定
6、连接产物转化
DH5α感受态细胞
30min。
（1）10μＬ连接产物和200μＬ感受态细胞在无菌条件下混匀，冰置（2）42℃水浴热激90s，立即放置冰上
90s。
（3）加入890μL 已预热至37℃的SOC液体培养基，37℃扩培，180 r/min振荡l h。（4）振荡培养后，将菌液按不同梯度的量涂布于含有平板。
（5）待菌体吸附后（约计算转化效率。
（6）挑取重组菌落，接种至
1.5mL离心管（含1mL LB+Amp液体培养基）中，扩培备用。15min），倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜（约
14-16h），观察菌落颜色，
X-gal（40μＬ）、IPTG（4μＬ）的LB（Amp 60 μg/mL)
（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）
（1）步骤同（一）中的质粒的提取步骤。（2）将提取的质粒进行是否构建成功。五、实验要点
.
1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后凝胶成像系统拍照，检测重组质粒
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（一）T载体的制备、DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）
因为本试验使用的载体为
T载体，所以不需要插入片段与载体的同时酶切。如果需要在酶切反应之
后再进行连接反应时，应注意以下两点：
（1）限制性内切酶未能完全被灭活，使用乙醇沉淀可避免这一问题的发生。（2）DNA样品中混有可影响连接活性的杂质，酶解后的重溶于无菌蒸馏水中时常常会碰到这种问题。（二）大肠杆菌感受态细胞的制备
1、商品化的感受态细胞有2、对所用试剂如
PH 525、JB 101、Top 10、DH 5-2。
DNA直接用于连接时而不经过乙醇沉淀
CaCl2的要求很高，要注意质量与浓度。
3、用CaCl2法制备的感受态细胞在4℃放置过夜后感受态效率提高。
4、感受态细胞对冻融非常敏感。化冻的细胞不应重复冷冻，如果冰箱出了故障则应弃去并重新制备。（三）重组DNA的转化及重组子的鉴定
1、通常蓝色显色不太完全，可以将平板置于冰箱中放置过夜使颜色变深。
2、实验中应作对照，通常对照是取部分感受态细胞，用未酶解的载体质粒进行转化，应该得到一块长满蓝色克隆的平板，证明感受态细胞是好的。
3、除对照外，如果其他板上一个菌落也没有。出现这种问题的原因可能是连接酶失活，应当更换。4、平板上的菌长成菌苔状，出现这种情况可能有如下两个原因：
（1）对未转化的E.coli细胞缺乏选择压力，使它们同转化细胞一起生长，其原因是平板中缺乏抗生素或抗生素活性较低，在培养基未能充份冷却时即加入抗生素可能导致抗生素部分失活。
（2）E.coli菌株可能获得了含有抗生素抗性基因的质粒。这时应使用新鲜氨苄青霉素重新配制
LB平板，同时配制不含抗生素的平板，将贮存的细菌分别涂
在两种平板上，若该菌株能在含有氨苄青霉素的平板上生长，则说明该菌获得了某个质粒，应弃之，并且制备新鲜菌；若细菌在不含抗生素的平板上生长，在含氨苄青霉素的平板上不能生长，则说明在转化实验中所使用的平板或者没加抗生素，或者抗生素浓度不够。（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）
加入溶液Ⅱ进行蛋白质的变性过程中要记住两点：
（1）时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基
DNA也会断裂，这样会带来很多麻烦。
因组DNA的断裂会慢慢断裂；（2）必须温柔混合，不然基因组
六、实验仪器及耗材
1、实验仪器：水浴锅、摇床、高压灭菌锅、无菌操作台、移液枪、冻冷离心机、紫外分光光度计（型）、离心机、移液管、超低温冰箱、电子天平、接种环、涂布棒、冰浴、培养箱、振荡器玻璃器皿（三角瓶、平皿）、试管、制冰机、冰盒、计时器、磁力搅拌器。
.
721
（Vortex）、饭盒、
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2、耗材：0.2mL PCR管、0.5mL离心管、1.5mL 离心管、10mL离心管、液氮（罐）、一次性手套、滤纸、沙布、脱脂棉、
Tip头（各种大小）。
七、实验主要试剂及配制方法（一）实验主要试剂
1、T载体的制备
Amp抗生素、胰化蛋白胨、酵母提取物、丙醇、乙酸钾、冰乙酸、
NaCl、NaOH、SDS、苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）、异
Ex Taq酶、dNTP、XcmⅠ酶、Buffer、ddH2O。
70%乙醇、氯霉素、引物、
2、DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）
PCR产物（插入DNA）、pMD20-T载体（大连宝生物生产）、ddH2O、T4 DNA连接酶、Buffer。3、大肠杆菌感受态细胞的制备胰化蛋白胨、酵母提取物、无菌水、4、重组DNA的转化及重组子的鉴定
PCR产物连接混合物、感受态细胞、合适的对照
DNA、LB培养基（每升中含有
10g胰蛋白栋、5g
15g琼脂，
NaCl、NaOH、TOP10菌种、DH5α菌种、葡萄糖、CaCl2。
酵母浸膏、10g NaCl，用5M NaOH调节pH7-8）、LB氨苄青霉素平板（每升再加入氨苄青霉素至终浓度为
100μg/mL）、氨苄青霉素（用灭菌蒸馏水配制
LB培养基中加入
50mg/mL的贮液）、IPTG（取
20mg/mL，溶于二
2g溶于8mL双蒸馏水中，定容至10mL，过滤除菌，-20℃保存）、X-gal（贮液浓度为
甲基甲酰胺中，-20℃暗处保存）、SOC培养基。
5、质粒DNA的提取（碱裂解法）胰化蛋白胨、酵母提取物、HB 101大肠杆菌菌株、葡萄糖、（二）配制方法
1、LB液体培养基（不加抗生素）
去离子水胰化蛋白胨母提取物NaCl
950m 10g 5g 10g
1L，在151bf/in
2
NaCl、NaOH、氯霉素（34mg/mL，溶于乙醇，工作浓度为170μg/mL）、
TrisHCl·、EDTA-Na2·2H2O、SDS、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、无菌水、
摇动至完全溶解，用5moL/L NaOH（约0.2mL）调pH至7.0，加入去离子水至总体积为（1.034×105pa）高压灭菌20min。2、0.1M CaCl2配制
CaCl2加H2O至
.
2.3g
200mL（灭菌）
3、5moL/L NaOH（NaOH分子量=40）
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将200gNaOH溶于450mLH2O中，加水定溶至4、LB培养基（Lμria-Bertani培养基）
去离子水
细菌培养用胰化蛋白胨（细菌培养用酵母提取物（
NaCl
摇动容器直至完全溶解，用
bacto-tryptone）bacto-yeast extract）
1L。
950mL 10g 5g
10g
5moL/L NaOH（约0.2mL）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为
2
105Pa）高压灭菌20min。1L，在151bf/in（1.034×
5、溶液I（GTE溶液）
50mmoL/L 25mmoL/L 10mmoL/L
葡萄糖（MV=180.16）
TrisHCL·（pH8.0）（MV=121.14）
EDTA（pH8.0）（EDTA Na2·2H2O的MV=372.24）
0.9g葡萄糖，0.302g Tris?HCL，0.372 g EDTA Na2·2H2O→定容100mL→调
配制100mL溶液I：pH8.0→高压蒸气灭菌
15min→４℃贮存
6、5moL/LNaOH：（NaOH分子量=40）
将200g NaOH溶于450mL H2O中，加H2O定容至1L 7、溶液II
0.2moL/L NaOH，临用前用10moL/L（40g溶于100mL）贮存液现用现稀释1% SDS （W/V，g/mL）
配制：1g SDS+ 2mL 10moL/L NaOH →8、5moL/L 乙酸钾
49.1g乙酸钾溶于100mL纯水，-20℃贮存9、溶液
Ⅲ溶液
100mL
配制100mL溶液: 乙酸钾（5 moL/L）冰乙酸水
10、1M TrisHCl·，pH=8.0
TrisHCl·：浓HCl：加H2O至：
.
60.0mL 11.5mL
28.5mL
121.1g 42mL 1L
15min
60.55g 21mL 500mL
——→高压灭菌
11、0.5M EDTA-Na2·2H2O，pH=8.0
EDTA-Na2·2H2O：186.1g 93.05g 55.83g 加H2O至：
1L
500 mL
300 mL
加NaOH调pH=8.0（约需20gNaOH颗粒）
——→高压灭菌
12、氯霉素抗生素溶液
贮存液：34mg/mL，溶于乙醇，放于不透光的容器-20℃保存。
工作浓度：170 μg/mL13、SOC培养基
胰化蛋白胨（g）20 酵母提取物（g）5 NaCl（g）
0.5 KCl（250mmol/L）10mL
混合后定容至1L
八、思考题
1、什么是T-载体？
2、pMD18-T载体是一种什么样的载体？3、用于基因克隆的载体的基本特性都有那些？4、为什么选择
16℃进行连接反应，而不选择连接酶的最适作用温度
5、什么是感受态细胞？
6、对于感受态细胞的两种解释是什么？7、什么叫重组子？
8、分子在转化过程中经历的四个阶段是什么？9、“蓝-白”筛选的原理是什么？10、SOC液体培养基震荡培养1～1.5h目的是什么？
11、碱裂解法制备质粒
DNA的实验原理是什么？
12、为什么向培养细菌的培养基中加入抗生素（如氯霉素）？
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