CpG联合MUC1增强人外周血树突状细胞功能的实验研究

现代肿瘤医学２０１７年２月第２５卷第０４期　ＭＯＤＥＲＮ　ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．２０１７，ＶＯＬ．２５，ＮＯ．０４　・５２５・　ＣｐＧ联合ＭＵＣ１增强人外周血树突状细胞功能的实验研究　徐　富　，谢映红　，杨翔云　，刘　云　，郑晓华　，吴　炎　，张　昊　，徐路　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣｐＧ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＵＣ１　ｉｎ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈＵｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　Ｘｕ　Ｆｕ　，Ｘｉｅ　Ｙｉｎｇｈｏｎｇ　，Ｙａｎｇ　Ｘｉａｎｇｙｕｎ　，Ｌｉｕ　Ｙｕｎ　，Ｚｈｅｎｇ　Ｘｉａｏｈｕａ　，Ｗｕ　Ｙａｎ　，Ｚｈａｎｇ　Ｈａｏ　，Ｘｕ　Ｌｕ　Ｃａｄｒｅ　Ｗａｒｄ；　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２０２　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ旃ｅ　Ｐ　，Ｌｉａｏｎｉｎｇ　Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００３，Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＣｐＧ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｕｃｉｎ　１（ＭＵＣ１）ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎ—　ｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ（ＤＣ）ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈ—　ｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｅｌｌ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ＧＭ—ＣＳＦ，ＩＬ一４　ａｎｄ　ＴＮＦ—ｏ／．ｉｎｄｕｃｅｄ　ＤＣ．Ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒｓ　ＣＤＳ０　ａｎｄ　ＣＤ８６．Ｈａｒｖｅｓｔ　ＤＣ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａ：ＤＣ，Ｂ：ＤＣ＋ＣｐＧ，Ｃ：ＤＣ＋ＭＵＣ１，Ｄ：ＤＣ＋ＣｐＧ＋ＭＵＣ１，Ｅ：ＣｐＧ＋ＭＵＣ１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＭＴＦ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＤＣ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ：　ＣＤ８０　ｃｅｌｌｓ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　７０．４％，ＣＤ８６　ｃｅｌｌｓ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　７２．０％，ｓｈｏｗｉｎｇ　ａ　ｍａｔｕｒｅ　ＤＣ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ＭＵＣ１　ａｎｄ　ＤＣ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＤＣ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．　ＣｐＧ＋ＤＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＭＵＣ１＋ＤＣ　ｇｒｏｕｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｕｒｅ　ＤＣ　ｇｒｏｕｐ，Ｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉ—ｆ　ｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ（Ｐ＜０．０１）．ＣｐＧ＋ＭＵＣ１＋ＤＣ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｗｉｔｈ　ＭＵＣ１　ｏｒ　ＣｐＧ＋ＤＣ　ｇｒｏｕｐ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１），ｔｈｅ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣｐＧ　ａｎｄ　ＭＵＣ１（ＤＣ—ｆｒｅｅ　ｇｒｏｕｐ）ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｓｔｉｍｕｌａ—　ｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＣｐＧ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＵＣ１　ｃａｎ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＣ　ｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ＣｐＧ，ｍｕｃｉｎ　１（ＭＵＣ１），ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ（ＤＣ）　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２０１７，２５（０４）：０５２５—０５２８　【摘要】　目的：观察ＣｐＧ联合黏蛋白１（ＭＵＣ１）应用对树突状细胞（ＤＣ）刺激Ｔ细胞增殖作用的影响。方法：　应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，体外培养应用ＧＭ—ＣＳＦ、ＩＬ一４、ＴＮＦ一　等细胞因子诱导ＤＣ，　观察细胞形态，并通过流式细胞术检测细胞标志物ＣＤ８０、ＣＤ８６。收获ＤＣ按如下分组：Ａ：ＤＣ；Ｂ：ＤＣ＋ＣｐＧ；　Ｃ：ＤＣ＋ＭＵＣ１；Ｄ：ＤＣ＋ＣｐＧ＋ＭＵＣ１；Ｅ：ＣｐＧ＋ＭＵＣ１，分别与Ｔ淋巴细胞混合培养，通过ＭＴＴ法检测Ｔ细胞增　殖情况。结果：ＤＣ表型检测结果为：ＣＤ８０　细胞占７０．４％，ＣＤ８６　细胞占７２．０％，呈现成熟ＤＣ表型。ＭＵＣ１　与ＤＣ联合疫苗与淋巴细胞混合培养显示：ＤＣ具有刺激Ｔ细胞增殖的作用，ＣｐＧ＋ＤＣ组和ＭＵＣ１＋ＤＣ组，　分别较单纯ＤＣ组对Ｔ细胞的刺激增殖作用明显增强（Ｐ＜０．０１），ＤＣ＋ＣｐＧ＋ＭＵＣ１组又明显高于单用ＭＵＣ１　或ＣｐＧ＋ＤＣ组，差别显著（Ｐ＜０．０１），单纯加ＣｐＧ和ＭＵＣ１（无ＤＣ组）则基本无明显刺激Ｔ细胞增殖作用。　结论：ＣｐＧ联合ＭＵＣ１能明显提高ＤＣ促Ｔ细胞增殖的功能。　【关键词】ＣｐＧ；黏蛋白１（ＭＵＣ１）；树突状细胞（ＤＣ）　【中图分类号】Ｒ７３—３５．１　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２—４９９２一（２０１７）０４—０５２５—０４　ＣｐＧ　ＯＤＮ是以非甲基化的ＣｐＧ基序为核心的ＤＮＡ序　列，机体细胞Ｔｏｌｌ样受体９（ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　９，ＴＬＲ９）能识　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—４９９２．２０１７．０４．０５　树突状细胞（ＤＣ）、Ｂ细胞和Ｔ细胞等多种免疫细胞，诱导并　增强非特异性及特异性免疫应答；同时还可以诱导产生Ｔｈｌ　型免疫反应，下调Ｔｈ２型反应。调控免疫应答类型。ＤＣ是　目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞，在抗原加工提　呈、抗原识别及Ｔ细胞激活中发挥重要作用。对多种肿瘤细　别ＣｐＧ—ＤＮＡ，触发机体产生免疫应答，ＣｐＧ具有强大的免　疫调节作用，能够激活自然杀伤（ＮＫ）细胞、单核／巨噬细胞、　【收稿日期】　２０１６—１０—０３　【基金项目】　辽宁省自然科学基金资助项目（编号：２０１３０２０１８１）　　检验科，辽宁【作者单位】　解放军第２０２医院干部病房；１１０００３　胞具有杀伤作用　Ｊ。近年来关于Ｄｃ与ＣｐＧ的研究逐渐深　入，发现ＣｐＧ能刺激ＤＣ的成熟并增强其活性，可作为免疫　佐剂，提高免疫治疗疗效　。黏蛋白１（ＭＵＣ１）是一种膜结　合型跨膜糖基化蛋白，在许多组织的上皮细胞表面都有表　沈阳　【作者简介】　徐富（１９６５一），男，黑龙江人，副主任医师，硕士，主要　从事肿瘤综合治疗及老年病诊治工作。Ｅ—ｍａｉｌ：　ｘｆ６６６２０００＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ　达。ＭＵＣ１在大多数肿瘤中常出现异常表达，异常糖基化，可　以作为肿瘤共同抗原　。因为ＭＵＣ１为自身抗原，免疫原性　・５２６・　徐南，等　ＣｐＧ联合ＭＵＣ１增慢人外　检测　书叶突状细胞功能的实验研究　弱木实验将ＣＰＧ　ＭＵＣ１联合作用于ＤＣ，并观察对ＤＣ　功能的影响　１材料与方法　１．１主要试剂和材料　１．４　ＣｐＧ联合ＭＵＣ１刺激ＤＣ及混合淋巴细胞反应　调整ＤＣ浓度为ｌ　Ｘ　１０　／ｍｌ　ＪＪｌ】入２４孔板，根据预试验结　果，分别加入ＣｐＧ（１Ｏｔｘｇ／ｍ１）和ＭＵＣ１蛋白（２０ｔａｇ／ｍ１），培养　ＭＵＣＩ蛋白购白美同ＭＡＣＳ公司；ＣｐＧ　ＯＤＮ２００６由Ｊ二海　７２ｈ，收获ＤＣ再与Ｔ淋巴细胞混合培养，按如下分绀：Ａ：ＤＣ；　Ｂ：ＤＣ＋ＣｐＧ；Ｃ：ＤＣ＋ＭＵＣ１；Ｄ：ＤＣ＋ＣｐＣ，＋ＭＵＣｌ；Ｅ：ＣｐＧ＋　生Ｉ　生物’１：程公司合成；重组人粒细胞一　噬细胞集落刺激　【太ｌ子（ｒｈＧＭ—ＣＳＦ）、重组白细胞介素４（ｒｈｌＬ一４）、重组人白　细胞介索一２（ｒｈｌＬ一２）、肿瘤坏死因子一ｄ（ＴＮＦ—Ｏｒ．）购白　Ｐｅｐｒｏｔｅ（　ｈ公Ｉ　；ＲＰＭＩ　１６４０、Ｍ１丫ｒ、Ｉ）ＭＳＯ购自荚目Ｓｉｇｍａ公　ＭＵＣ１　各组ＤＣ作为刺激　胞，复苏州种蚌体Ｔ淋巴细胞，　将ＤＣ和Ｔ淋巴细胞以不　的比例（１：ｌ０；ｌ：２０；ｌ：５０）混合，　培养７２ｈ后进行Ｍ　几　愉洲　１．５　ＭＴＴ检测　荧光标　的鼠抗人ＣＤ８０、ＣＤ８６单克隆抗体购白ｅＢｉｏ—　ｓｃｉｅｎｃｅ公州　胎牛ｍ清购自美罔Ｈｙｃｌｏｎｅ公司　１．２　ＤＣ体外培养　采集　常人抗凝外怙Ｊ血３０ｍｌ，ＪｔＪ　ＰＢＳ　Ｉ：ｌ稀释，缓慢加入钊　将各组待检测细胞７ＪＩＪ入５ｎ１　ｍｌ的Ｍ　Ｉ　ｒ，　于３７℃培养　箱中孵育４ｈ，小心吸大【　清（贴　细胞形成的紫色纳ｆ　值，进行数据分析　１．６统计学方法　胞），殳¨怂？？ｆｉｌｌ胞！Ｊ！ＪＩ先进　４９０ｒｉｍ处ＯＤ　行离心后冉吸出ｆ　清，『ＪＩＪ入２００￣１　ＤＭｓ（）震荡１０ｒａｉｎ以溶解　细胞分离液巾，２　０００ｒ／ｒａｉｎ常温离心３０　ａｉｒｎ，吸取界皿层细胞，即　为单个核细胞（ＰＢＭＣ），川含有１０Ｕ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ、１００Ｕ／ｍｌ肯霉　素及ｌＯ０￣ｇＪｍｌ链堪素的无ｍ清ＲＰＭＩ　１６４０重悬，调整细胞　浓度为ｌ×１０　个／ｍｌ，加入６孑Ｌ板，每￣Ｌｈｌ１人细胞怂液２ｎｄ，　３７　ｏ【　，５％ＣＯ　培养箱培养２　ｈｌ　用预热的ＰＢＳ清洗培养板２　次，吸…细胞悬液（为外周血淋巴细胞ＰＢＩ　，采用尼Ｊ它毛柱法　胁标仪Ｉ　测定　应用ＳＰＳＳ　１９．０统汁软件分析，数据以　４－　丧爪，绀间　比较采』｛ｊ＿方差分析，，’＜０．０５为篪　仃统计学意义　２结果　分离Ｔ淋巴细胞，冻存备朋）　留下贴擘细胞，每孑Ｌ加入　２ｍｌ　ＤＣ完全培养基（含１０％胎牛ｍ清、ＧＭ—ＣＳＦ　ｌＯＯｎｇ／ｍｌ　及ＩＬ一４　５０ｎｇ／ｍｌ的ＲＰＭ１　１６４０）培养，第３灭半量换液，补允　新鲜细胞　子；第５天每孔加　＼０．４１ｘｌ的ＴＮＦ—ｄ（１Ｏｎｇ／ｍ１），继　续培养２天诱导其成熟　，　１．３　ＤＣ表型鉴定　２．１　ＤＣ培养鉴定　外周血　个核细胞经ｒｈｌｌ　一４及ｒｈＣＭ—ＣＳＦ刺激诱导　后，第３天可　细胞体积增人．　形或椭　Ｊ髟；第５天，细胞　周边出现短的毛刺状突起，　Ｊｔ：始…现悬浮；第７天，经ＴＮＦ　刺激后细胞悬浮逐渐增多，表而突起数　增多，体积增　ＤＣ表型检测结果为：（：Ｉ）８０　细胞【　７０．４％，ＣＤ８６　大，表而毛刺明显增多变Ｋ，‘　删成热ＤＣ形态　细胞　７２．０％，Ｉｔ　脱成熟ＤＣ　｝　、　３．０％（　１）　取厌导后的ＤＣ，Ｙ１］ＰＢＳ漂洗３次，ＰＢＳ　悬细胞，调祭　浓Ｊｊ｛＝为ｌ×１０　／ｍｌ　流式管｜『ｌ加入带有标记的ＣＤ８０、ＣＤ８６　５ＪＪ忡埘照绀小于　抗体（　ｒ｝Ｉ包括对照管），３７℃孵育３０ｒａｉｎ，离心收集细胞，小　心Ｉ发ｌ　Ｉ：消，ＰＢＳ渫洗３次　５００Ｉｘｌ　ＰＢＳ重悬细胞，进行流式　一　１０　Ｑ２一ｕＬ　１２．Ｏ％　ｌ０　耳　ｌ０　ｉ潮　譬要　’　ｔ）２一ＬＲ　ｌ０　４％　ｌＯ　ｊ焉　：Ｏ晓　Ｌ　１７　５％　　’１０　０　１０　ＦＬｌ—Ａ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏ　ＦＬ】．Ａ　ＣＤ８０　ＣＤ８６　图１　ＤＣ表型测定流式细胞图　Ｆｉｇ．１　Ｆｌｏｖ，ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｆｉｇｕｒｅ　ｏｆ　ＤＣ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ　２．２不同效靶比及不同ＤＣ组对淋巴细胞的增殖刺激作用　统计学意义，提示较低浓度的Ｉ）Ｃ即可发挥较ｕ』ｊ｛ｌＩｊ．的刺激Ｔ　淋巴细胞增殖的作川（衷１）　３讨论　ＤＣ对淋巴细胞的刺激增殖作用结果提示：体外培养的　人外周　ＤＣ具有刺激Ｔ细胞增殖的作川，ＤＣ加入ＣｐＧ或　ＭＵＣＩ后，较　纯ＤＣ绀对Ｔ细胞的刺激增殖作川明　增强，　ＣｐＧ是指含有ｉＩｆＩｊ腿化的胞嗡啶和屿嘌呤核甘酸核心　的寡聚脱氧核苷酸序列，能够激活体内的多种免疫细胞，使　Ｉ姒】　比较柯　著芹异（Ｐ＜０．０１），　时ＤＣ＋ＣｐＧ＋ＭＵＣｌ绀　义川　高丁单用ＭＵＣｌ或ＣｐＧ＋ＤＣ纰，差别显著（尸＜　０．０１），单纯ＣｐＧ和ＭＵＣ１（无ＤＣ组）则基本尤Ｔ细胞刺激　之分泌多种生物活性　：Ｆ干¨　胞　子，ＣｐＧ作为ＴＬＲｓ配体　可刺激ＤＣ成熟及　化，能使ＤＣ膜表　分子如ＣＤ８０、ＣＤ８３、　ＣＩ）８６、ＨＬＡ　Ｉ和ＨＩ　Ａ　ｌ１分子　达增加，诱导细胞　子１Ｉ　一６、　ＩＬ一１２、ＴＮＦ一　币ｌＪ　１１＇’Ｎ一（】【ｎ　分泌【』ｌｊ　５ｔ　，通过ｌ　述多种　增殖作用　而不同浓度ＤＣ／Ｔ效靶比，１：２０和１：５０组对Ｔ　细胞刺激增殖作川相对丁１：１０组ｆ『增高的趋势，但无明　２０１７年２月第２５卷第ｏ４期　ＭＯＤＥＲＮ　ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．２０１７，ＶＯＬ．２５，ＮＯ．０４　．５２７．　方式来影响Ｄｃ的功能　。可以提高实验动物的体液免　研究的报道　。有研究发现ＣＰＧ１８２６能提高免疫，同时联合　化疗具有协同抗肿瘤作用　。　疫及细胞免疫反应，在作为免疫佐剂、抗肿瘤增敏剂等方面　具有良好的应用前景。目前已经有ＣｐＧ制剂开始进行临床　表１　不同效靶比及不同ＤＣ组对淋巴细胞的增殖刺激作用　Ｔａｂ．１　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔ　ｒａｔｉｏｓ　ａｎｄ　ＤＣ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ＤＣ作为目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞，可以　同作用，负载ＭＵＣ１的ＤＣ疫苗在体外能显著促进抗原特异　性ＣＴＬ的增殖和活化。这为进一步抗肿瘤体外及体内实验　打下了良好的基础。　活化静息性Ｔ淋巴细胞使其成为抗原特异性Ｔ细胞（ＣＴＬ）。　将ＤＣ与Ｔ淋巴细胞混合培养，可明显促进Ｔ细胞的增殖。　但是肿瘤患者体内的ＤＣ不能对肿瘤细胞进行有效识别。通　过将负载在ＤＣ上的肿瘤抗原信息传递给Ｔ细胞从而制备　ＤＣ相关的肿瘤疫苗是近年来研究的热点。但仅有极少数获　【参考文献】　［１］Ｂｏｄｅ　Ｃ，Ｚｈａｏ　Ｇ，Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．ＣｐＧ　ＤＮＡ　ａｓ　ａ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｄｊｕ—　ｖｑｎｔ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＶａｃｃｉｎｅｓ，２０１１，１０（４）：４９９—５１１．　得临床客观疗效。ＭＵＣ１是Ｍｕｃｉｎｅｓ黏蛋白家族的重要成　员，广泛分布于上皮细胞表面，而在恶性肿瘤细胞出现异常　［２］　Ａｎｎｅ　Ｄｕｓｔｅｒ，Ｓａｓｋｉａ　Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｆｏｅｒｍｅｒ　Ｓ．ｅｔ　ａ１．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ—　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＣｐＧ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｍｉｍｉｃ　ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｖｅａｌ　表达，且由于糖基化不全使正常情况下隐蔽的抗原表位暴　露，成为肿瘤抗原，具有广谱性和肿瘤相对特异性，是肿瘤免　ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　９　ｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｖｉｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１３９（２）：１６６—１７８．　疫治疗的较理想的靶抗原　…。有部分ＭＵＣ１相关的肿瘤　疫苗已进入临床实验阶段，虽然在Ⅱ期临床取得阳性结果，　但Ⅲ期临床效果不佳　。现在已经有研究ＣｐＧ和ＭＵＣ１联　合，或ＣｐＧ联合ＤＣ抗肿瘤的实验研究　”　。近期的一项研　［３］Ｐｉｃｈｉｎｕｋ　Ｅ，Ｂｅｎｈａｒ　Ｌ，Ｊａｃｏｂｉ　Ｏ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｃｅｌｌ—　ｂｏｕｎｄ　ＭＵＣ１　ＳＥＡ　ｄｏｍａｉｎ　ｋｉｌｌｓ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２０１２，７２（１３）：３３２４—３３３６．　［４］　Ｇｅａｒｙ　ＳＭ，Ｌｅｍｋｅ　ＣＤ，Ｌｕｂａｒｏｆｆ　ＤＭ，ｅｔ　ａ１．Ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｕ—　ｓｉｎｇ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　究应用表达ＭＵＣ１抗原的安卡拉病毒疫苗（ＭＶＡ—ＭＵＣ１）　联合ＣＰＧＩ８２６治疗肾癌动物模型，发现该疫苗能增加ＣＤ８　Ｔ细胞，并能延长实验动物的总生存期。其中ＣｐＧ本身并不　增加ＣＤ８　Ｔ细胞数量，但可以改善肿瘤局部的微环境，促进　Ｔｈｌ、免疫记忆Ｔ细胞、Ｂ细胞、ＤＣ向肿瘤局部聚集。从而协　ＣｐＧ　ＯＤＮ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１１，６０（９）：１３０９—　１３１７．　［５］Ｈａｃｋ　Ｋ，Ｒｅｉｌｌｙ　Ｌ，Ｐｒｏｂｙ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｗｎｔ５ａ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｈｅ　ＣｐＧ　ｏｌｉｇｏｄｅ—　ｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ——ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ　ｄｅｎｄｆｉｔ—　ｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，３７（５）：　５５７—５６１．　同疫苗提高免疫治疗的疗效　。　为了提高ＭＵＣ１的免疫原性，更有效地发挥其免疫激活　和对肿瘤细胞的杀伤作用，同时充分发挥ＣＰＧ的免疫佐剂　的作用和ＤＣ强大的抗原提呈功能，本实验将ＣｐＧ、ＭＵＣ１和　［６］　Ｒｅｎａｔａ　Ｕｒｓｕ，Ｓｏｐｈｉｅ　Ｔａｉｌｌｉｂｅｒｔ，Ｂａｎｉｓｓｉ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ＣｐＧ—ＯＤＮ　ｉｎ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ：Ａ　ｐｈａｓｅ　Ｉ　ｔｉｒｌ［Ｊ］．ａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，１０６（９）：１２１２—１２１８．　ＤＣ联合应用，观察对ＤＣ功能的影响。实验结果发现，应用　ＣＰＧ可以增强ＤＣ的活性，即加入ＣｐＧ后的ＤＣ组较单纯ＤＣ　［７］　Ｊｏｒｄａｎ　Ｍ，Ｗａｘｍａｎ　ＤＪ．ＣｐＧ一１８２６　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｎｄ　ａｎｔｉ——ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｍｅｔｒｏ—　ｎｏｍｉｃ　ｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ　ｉｎ　ａ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｇｌｉｏｍａ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１６，３７３（１）：８８—９６．　组对Ｔ细胞的刺激能力明显增强（Ｐ＜０．０１）。ＭＵＣ１处理后　的ＤＣ刺激Ｔ细胞的活性也明显强于单纯ＤＣ组（Ｐ＜０．０１）。　经过ＣｐＧ和ＭＵＣＩ同时处理的ＤＣ较二者单纯处理的ＤＣ又　［８］　Ｓｃｈｕｍａｎ　ＪＴ，Ｇｒｉｎｓｔｅａｄ　ＪＳ，Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｉｎ　ａ　ＭＵＣ１　ｐｅｐｔｉｄｅ　能进一步提高刺激Ｔ细胞的能力。结果提示ＣｐＧ不但可以　增强ＤＣ活性，同时还可以作为免疫佐剂协同ＭＵＣ１进一步　增强ＤＣ的活性（Ｐ＜０．０１），实验发现不同浓度ＤＣ／Ｔ效靶　比，对Ｔ细胞刺激增殖作用无显著差别，即较低浓度ＤＣ即可　明显刺激Ｔ细胞增殖。上述结果表明ＣｐＧ和ＭＵＣ１分别与　ｔｕｍｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００５，７７（２）：１０７—１２０．　［９］　Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｃｈｅｎ　Ｈ，Ｌｉｕ　ＦＨ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＭＵＣ１　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　ａｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｉｎ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　２０１１，３００（２）：１２２—１３３．　ＤＣ联合应用时具有增强ＤＣ活性的作用，将二者同时应用处　理ＤＣ时又能进一步增强ＤＣ刺激Ｔ淋巴细胞增殖的活性。　［１０ｊ　Ｈｏｕ　Ｒｕｉ，Ｊｉａｎｇ　Ｌｕｏ，Ｌｉｕ　Ｄａｗｏ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＵＣ１　ｉｎ　ｏｖａｒ－　ｉａｎ　ｓｅｒｏｕｓ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ［Ｊ］．Ｍｏｄｅｒｎ　Ｏｎｃｏｌｏ－　ｙ，ｇ２０１２，２０（６）：１２５０—１２５３．　以负载ＭＵＣ１的ＤＣ为基础而构建肿瘤疫苗，诱导ＣＴＬ，具有　特异性肮肿瘤免疫反应。Ｗａｎｇ等人研究发现ＤＣ负载　ＭＵＣ１后在体外可以增加特异性ＣＴＬ活性，体内具有抗肿瘤　作用，同时发现增加注射疫苗次数可以提高抗肿瘤效应　。　［１１］Ｚｈａｎｇ　Ｐ，Ｙｉ　Ｓ，Ｌｉ　ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｉｐｌｅ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｌｅｅｔｒｏｆｕｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄａｙ一３　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　［Ｊ］．ＰＬｕＳ　Ｏｎｅ，２０１４，９（７）：ｅ１０２１９７．　［１２］　Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ　Ｊ，Ｋｉｄｉｙｏｏｒ　Ａ，Ｂｅｓｍｅｒ　ＤＭ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ＣｐＧ——ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ——ＭＵＣ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ＮＫ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉ——　我们的实验在ＭＵＣ１负载ＤＣ的基础上，再联合应用ＣｐＧ进　一步增强疫苗的免疫活性，实验证实了ＣｐＧ和ＭＵＣ１具有协　ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１２，６１（１１）：　・５２８・　ＵＣ５７——ＣＴＰ——ＰＴＥＮ　２Ｏ５５—２Ｏ６５．　ｍｅｒｉｔ　ｗｉｔｈ　Ｍｏｄｉｉｆｅｄ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓ　Ａｎｋａｒａ　ａｎｄ　ＴＬＲ９　ｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．　Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，４（５）：ｅ１００３０１３．　［１３］　Ａｈｅｂｅｒ　Ｚ，Ａｚｕｌａｙ　Ｍ，Ｃａｆｒｉ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｃｒｙｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｌｏｃａｌ　ｃｏ—．ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＸ　ｖｉｖｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｉｌｓ　ａｎｄ　ＣｐＧ—－　［１５］Ｗａｎｇ　ｚ，Ｈａｌｌ　ＭＤ，Ｒｅｗｅｍ—Ｆｅｌｋｉｎｓ　ＫＡ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｅｎ—　ｈａｎｅｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＭＵＣ１一ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ　ＯＤＮ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ，ｅｌｉｃｉｔｓ　ａ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１４，６３（４）：３６９—３８０．　［１４］　Ｐｒｒｖｉｌｌｅ　Ｘ，Ｒｉｔｔｎｅｒ　Ｋ，Ｆｅｎｄ　Ｌ．Ｓｈａｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｍｉｃｍｅｎｖｉｍｎ－　ａｇａｉｎｓｔ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，２（２）：１５２—　１５４．　（编校：蔺明）　原核表达重组质粒ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ的构建及鉴定　喻备　，黄媛　，胡海峰　，汪自力　，杨进　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｆｆｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７　——ＣＴＰ——ＰＴＥＮ　Ｙｕ　Ｂｅｉ　，Ｈｕａｎｇ　Ｙｕａｎ　，Ｈｕ　Ｈａｉｆｅｎｇ　，Ｗａｎｇ　Ｚｉｌｉ　，Ｙａｎｇ　Ｊｉｎ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＵｒｏｌｏｇｙ；　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＣｈｅｎｇｄｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００８１，Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ　ｏｆ　ＣＴＰ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＰＴＥＮ　ｇｅｎｅ，ａｎｄ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗ—ｕｐ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｇｅｎｅ　ＣＴＰ—ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅ—　ｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＵＣ５７　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７——ＣＴＰ—。　ＰＴＥＮ．Ｔｈｅｎ　ｉｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｃ￣．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｆｉｃｔｉｒｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉ—　ｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｇｅｎｅ　ＣＴＰ—　ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７一ＣＴＰ～ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｗａｓ　ＳＵＣ—　ｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５　ｏ【．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＵＣ５７，ＣＴＰ，ＰＴＥＮ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２０１７，２５（０４）：０５２８—０５３０　【摘要】　目的：合成基因ＣＴＰ及ＰＴＥＮ基因，构建其原核表达重组质粒ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ，为后续研究其　功能做准备。方法：合成基因ＣＴＰ—ＰＴＥＮ，将该基因定向克隆到原核表达载体ｐＵＣ５７中，构建ｐＵＣ５７一ＣＴＰ　—ＰＴＥＮ重组质粒，转化大肠杆菌ＤＨＳｃ￣菌株，抽提质粒进行双酶切、测序鉴定后，用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检验表　达。结果：测序鉴定ＣＴＰ—ＰＴＥＮ基因合成成功。经双酶切、测序鉴定证实重组质粒ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ成　功转入ＤＨ５ｃｔ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检验ｐＵＣ５７一ＣＴＰ—ＰＴＥＮ成功表达。结论：成功构建了重组质粒ｐＵＣ５７一ＣＴＰ　—ＰＴＥＮ，并在大肠杆菌ＤＨ５　ｏｌ中成功表达。　【关键词】质粒ｐＵＣ５７；ＣＴＰ；ＰＴＥＮ；构建；鉴定　【中图分类号】Ｒ７３０．１　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２—４９９２一（２０１７）０４—０５２８—０３　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—４９９２．２０１７．０４．０６　【收稿ＥＩ期】　２０ｌ６一Ｏ８一ｌ４　【修回日期】　２０１６——０８—．２９　【基金项目】　成都市医学科研课题（编号：２０１４００１）；成都学院校青年基金项目（编号：２０１４ＸＪＺ０８）；成都大学附属医院院内课题（编号：　２０１４０１６）　【作者单位】　成都大学附属医院泌尿外科；　检验科，四川成都６１００８１　ｌ：ｔｎｙｌＯｌ３＠１６３．ｅｃｒｕ　【作者简介】　喻备（１９８６一），男，四川成都人，医师，硕士，主要从事泌尿系肿瘤生物治疗研究。Ｅ—ｍａｉ【通讯作者】　杨进（１９７４一），男，四川成都人，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要从事泌尿系肿瘤研究及泌尿系生物组织工程　研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｒ．ｊｉｎｙａｎｇ＠１６３．ｃｏｒｎ