CBH

２０１５年７月　ｌ　ｌ４　第３６卷第１３期　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　食品研究与拜发　生物工程　ＤＯＩ．１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１５．１３．０３２　ＣＢＨ　ＩＩ和ＥＧ　ＩＶ的重构基因在里氏木霉中的　组成型表达　曾敏　・２。邓丽瑜　，汤新　，刘刚　，余少文　・’　（１．深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳５１８０６０；２．深圳大学生命科　学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳５１８０６０）　摘要：重构基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ｃＤ　表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶ＣＢＨ　ＩＩ和内切葡聚糖酶ＥＧ　ＩＶ　２种　催化活性，在纤维素降解等方面有着重要应用。本研究通过ｏｖｅｒｌａｐ　ＰＣＲ将里氏木霉丙酮酸脱羧酶（ＰＤＣ）的启动子、　纤维二糖水解酶ｃｂｈｌ的信号肽、重构基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ＣＤ　和ｐｄｃ终止子依次连接，以质粒ｐＰＩＣＺｃｔＡ为基本骨架，　构建表达载体ｐＰＩＣ—ＰＣＴ。采用原生质体转化法将ｐＰＩＣ—ＰＣＴ和含潮霉素抗性筛选标记的质粒ｐＡＮ７—１共转里氏木　霉。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析表明，重构基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ｃＤ　实现了在里氏木霉中的组成型表达，测得重组木霉发酵上清液　的ＣＭＣ　酶活最高达到４．０８Ｕ／ｍＬ，是出发菌株的５．５５倍，ＦＰＡ酶活达到０．９１５Ｕ／ｍＬ，较出发菌株提高了４３．６％。酶　学性质初步研究表明：粗酶液的最适ｐＨ为５．０，最适温度为５０℃。　关键词：基因重构；外切葡聚糖酶ＩＩ；内切葡聚糖酶ＩＶ；丙酮酸脱羧酶启动子　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＢＨ　Ｈ　ａｎｄ　ＥＧ　ＩＶ　ｆｏｒ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｒｅｅｓｅｉ　ＺＥＮＧ　Ｍｉｎ　，Ｄｅｎｇ　Ｌｉ－ｙｕ　，ＴＡＮＧ　Ｘｉｎ　，ＬＩＵ　Ｇａｎｇ１，ＹＵ　Ｓｈａｏ－ｗｅｎ　，　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５　１８０６０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　５　１　８０６０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｃｂｈ２－１ｉｎｋｅｒ－ＣＤ￣４　ｇａｉｎ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ａｄｄｅｄ　ｔｈｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ（ＣＤ）ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ｅｇ４　ｔｏ　ｔｈｅ　３　ｅｎｄ　ｏｆ　ｃｂｈ２．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｂｈ２－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ￣ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４　ｓｔｒｏｎｇ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＰＳｐｄｃ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ａｎｄ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｔｐｄｃ，ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｒｅｃｏｎｓｔｕｃｔｒｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＰＩＣ—ＰＣＴ．Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＰＩＣ—ＰＣＴ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＡＮ７－１　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ　ｖｉａ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＢＨ　ｌＩ－ＥＧ　ＩＶ　ｈａｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ．Ｔｈｅ　ＣＭＣ№ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　４．０８　Ｕ／ｍＬ．ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　５．５５一ｆｏｌｄ　ａｓ　ｈｉ　ｇｈ　ａｓ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎ；ｔｈｅ　ＦＰＡ　ｃａｔｉｖｉｔｙ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　０．９１５　Ｕ／ｍＬ．ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　４３．６％．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　５．０．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　ａｔ　５０℃．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉ０ｎ；ｃｅ１ｌｏｂｉ０ｈｙｄｒ０ｌａｓｅ　Ｉ１；ｅｎｄｏ－１３－１，４－ｇｌｕｃａｎａｓｅ　ＩＶ；ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｐｒｏ－　ｍｏｔｅｒ　纤维素酶能有效降解纤维素，将其水解成葡萄　糖，广泛应用于纺织、食品加工、酿酒、造纸和饲料等领　基金项目：深圳市基础研究计划（ＪｃＹＪ２Ｏ１２Ｏ６１３１１５３２３９８２）　作者简介：曾敏（１９８８一），女（汉），硕士研究生，研究方向：酶工程。　通信作者　域，对解决环境污染和能源危机具有重大意义［１－２１。纤　维素酶广泛存在于多种微生物中，其中里氏木霉（　一　ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）是目前研究最透彻的产纤维素酶模式　菌株【　，它产生的纤维素酶主要由内切型葡聚糖酶　（ｅｎｄｏ—ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ，ＥＧ）、外切型葡聚糖酶（ｅｘｏ—ｃｅｌ—　生物工程　曾敏，等：ＣＢＨ　ＩＩ和ＥＧⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达　ｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＣＢＨ）以及Ｂ一葡萄糖苷酶（Ｂ—Ｇｌｕｃｏｓｉ　ｄａｓｅ，简称ＢＧ）组成『５　，它们通过协同作用降解纤维　素［ｓｌ。其中只有ＣＢＨ可作用于纤维素结晶区域，从纤维　素分子的非还原端进行水解，而自然界中的木质纤维　素大都呈结晶状态，因此ＣＢＨ在纤维素降解过程中的　作用非常重要。纤维素酶有２个活性区域：催化结构　域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎｓ，ｃｏ）和纤维素结合结构域构（ｃｅｌ—　ｌｕｏｓｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｓ，ＣＢＤ）ｔ９－　Ｏｌ，其中ＣＤ是纤维素酶　的“活性中心”，在水解过程中起着重要作用。　根据纤维素酶各组分间的协同作用研究，人们发　现适当改变各组分的比例可提高纤维素酶的降解效　率。近年来，从分子结构水平改造纤维素酶基因，提高　纤维素酶的生物学活性已经取得了重大进展。Ｌｅｍｏｓ［１１１　等在基因ｃｂｈ２和ｅｇ中增加ＣＢＤ基因，提高了这两种　纤维素酶的活性。刘刚等㈣在ｅｇ４基因中增加一个其　自身的ＣＤ基因，使其重组蛋白活性提高了４倍。本实　验室在ｃｂｈ２下游增加ｅｇ４的ＣＤ基因，得到含２个催　化结构域的重构基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ＣＤ增４。本研究将该　基因与里氏木霉丙酮酸脱羧酶的组成型强启动子（含　信号肽）融合，构建里氏木霉组成型表达转化系统，以　期得到可以高效表达融合蛋白ＣＢＨ　ＩＩ—ＥＧ１Ｖ且具有　较高酶活力的重组木霉。　１材料与方法　１．１菌株及质粒　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ９４１４、大肠杆菌Ｅ　ｃｏｌｉ　ＴｏｐｌＯＦ’、质粒　ｐＰＩＣＺａＡ、ｐＡＮ７—１由本实验室保藏。ｐＭＤ　１　８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公司。质粒ｐＰＩＣ—ｃｂｈ２，ｐＰＩＣ—ｅｇ４　由本实验室前期构建。　１．２培养基　Ｍａｎｄｅｌｓ基础培养基：Ｍａｎｄｅｌｓ营养盐浓缩液　１００　ｍＬ几，Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素浓缩液１．０　ｍ王儿，无水葡　萄糖１０　ｇ／Ｌ，蛋白胨１．０　ｇ／Ｌ，１　Ｍ的柠檬酸缓冲液　（ｐＨ４．５）５０　ｍＬ／Ｌ，吐温８０　１．０　ｇ／Ｌ～２．０　ｇ／Ｌ。　筛选培养基：含有ＳＴＣ和潮霉素１００　ｔｘｇ／ｍＬ的　ＰＤＡ培养基。其中，ＳＴＣ、葡萄糖和ＰＤＡ培养基的其他　成分分为３部分各溶于约１／３的水中。　产酶培养基：５０ｘＭａｎｄｅｌｓ营养盐浓缩液２０　ｍ王儿，　１　０００ｘＭａｎｄｅｌｓ微量元素浓缩液１．０　ｍ【／Ｌ，黄豆饼粉　５０　ｇ／Ｌ，１　Ｍ柠檬酸缓冲液（ｐＨ　４．５）５０　ｍＬ／Ｌ，吐温８Ｏ　１．０　ｇ／Ｌ一２．０　ｇ／Ｌ，葡萄糖３０ｇ／Ｌ。　１．３表达载体ｐＰＩＣ—ＰＣＴ的构建　分别以实验室前期构建的质粒ｐＰＩＣ—ｅｇ４、ｐＰＩＣ—　ｃｂｈ２为模板，根据ＮＣＢＩ公布ｅｓ４、ｅｂｈ２序列设计引　物，经ＰＣＲ获得基因片段ｌｉｎｋｅ一、ＣＤ　和ｃｂｈ２。依次　经双酶切连接至质粒ｐＰＩＣＺｏｔＡ，重构质粒ｐＰＩＣ—ｃｂｈ２一　ｌｉｎｋｅｒ—ＣＤｅｇ４。　以里氏木霉基因组ＤＮＡ为模板，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ　报道的序列设计引物，分别经ＰＣＲ扩增获得纤维二糖　水解酶Ｉ信号肽序列Ｓｃｂｈｌ、丙酮酸脱羧酶启动子　Ｐｐｄｃ和终止子Ｔｐｄｃ序列。利用ｏｖｅｒｌａｐ　ＰＣＲ技术依次　连接ＰＳｐｄｃ、ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ｃＤ　、Ｔｐｄｃ，构建表达载体　ｐＰＩＣ－ＰＣＴ。　１．４里氏木霉的原生质体转化及筛选　表达载体ｐＰＩＣ—ＰＣＴ经Ｘｂａ　Ｉ酶切纯化处理后，与　含潮霉素筛选标记的质粒ｐＡＮ７—１共转　Ｒｅｅｓｅｉ，主　要参照Ｐｅｎｔｔｉｌａ等的方法进行［１３１。取适量转化液涂布　到含有１００￣ｇ／ｍＬ潮霉素的ＰＤＡ平板上，２８℃培养　观察３　ｄ～５　ｄ至平板上长出菌丝，挑取单菌落菌丝转　接至１００　Ｉ￣ｇ／ｍＬ潮霉素的ＰＤＡ小平板上进行复筛，　２８℃培养２　ｄ，再转接至新鲜无抗性ＰＤＡ小板上培养　７　ｄ～１０ｄ。　１．５重组木霉的组成型表达　用无菌水刮取ＰＤＡ培养平板上生长７　ｄ的木霉　转化子孢子，接种至含潮霉素抗性的Ｍａｎｄｅｌｓ基础培　养基中，２８℃，２２０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养１．５　ｄ～２　ｄ。以５％的　接种量转接至产酶培养基中，２８　ｏＣ，２２０　ｒ／ｍｉｎ，振荡培　养。１１　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ，收集上清，即为粗酶液，　每２４　ｈ取样一次检测粗酶液的酶活力。　１．６重组木霉的ＰＣＲ鉴定　以重组木霉基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增重构　基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ｃＤｅｇ４，以木霉基因组ＤＮＡ为对照，　用１％琼脂糖凝胶电泳进行检测并测序。　１．７重组木霉表达产物的分析　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳：取粗酶液进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，分析　融合蛋白ＣＢＨ　ｌＩ－ＥＧＩＶ的表达情况。　ＣＭＣＮａ酶活的测定：采用ＤＮＳ法测定内切葡聚　糖酶的活性【ｌ４１，酶活力单位（ｕ）定义为１　ｍｉｎ水解生成　１　Ｉ￣ｍｏｌ葡萄糖所需的酶量。取适当稀释后的粗酶液　０．５　ｍＬ与１％ＣＭＣ—Ｎａ（用０．０５　Ｍ柠檬酸缓冲液配制，　ｐＨ４．８）于５０℃水浴中反应３０　ａｒｉｎ，立即加入３　ｍＬ　ＤＮＳ终止酶反应，充分混匀，沸水浴５　ｒａｉｎ，冷却，充分　混匀后测０Ｄ　。每组实验做３个重复。　滤纸酶活（ＦＰＡ）的测定：取０．５　ｍＬ适当稀释后的　粗酶液、１　ｍＬ柠檬酸缓冲液（０．０５　Ｍ，ｐＨ４．８）及５０　ｍｇ的　滤纸条（Ｗｈａｔｍａｎ　ＮＯ．１）在５Ｏ℃水浴中反应３０　ｍｉｎ，立　即加入３　ｍＬＤＮＳ终止酶反应，充分混匀，沸水浴５　ｍｉｎ，　冷却，充分混匀后测ＯＤ　。每组实验做３个重复。　生物工程　曾敏，等：ＣＢＨⅡ和ＥＧⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达　呈　赡　溢　呈　Ｕ　ｐＨ　图６粗酶液的最适ｐＨ　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　ｏｆ　ｃｒｕｄｅ　ｅｎｚｙｍｅ　如图７所示，粗酶液的最适反应温度为５Ｏ　ｃ【＝，在　５Ｏ℃一６０℃范围内相对酶活较高，在７０℃时还能保持　最高酶活的６６．６％，当温度达到８０℃时，酶活急剧　下降。　耋　囊　避　吞　吞　３０　４０　５０　６０　７０　８０　温度／℃　图７粗酶液的最适温度　Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｒｕｄｅ　ｅｎｚｙｍｅ　３结论与讨论　纤维素酶应用广泛，但因酶活低、成本高等因素　不能进行大规模工业化生产和应用ｔ堋。近年来，通过基　因工程技术来获得高活性、高产量的纤维素酶逐渐受　到重视。本研究对纤维素酶ｃｂｈ２和ｅｇ４进行重构，获　得具有２个催化结构域的重构基因，它表达的蛋白具　有这２种纤维素酶组分的催化活性，在实际应用中具　有更广阔的前景。　里氏木霉能高效合成和分泌蛋白质，是高产纤维　素酶的代表菌种。它常使用ｃｂｈｌ启动子构建表达系　统　８１，实现目的基因的同源或异源表达，但ｃｂｈｌ启动　子需要纤维素或乳糖的诱导才能调控目的基因的表　达。此外，诱导物也能诱导里氏木霉其它纤维素酶的　表达，加大了目的蛋白分离、纯化的难度。ｕ等【・９１通过　ＲＴ—ｑＰＣＲ技术从里氏木霉中筛选出可以使木聚糖酶　Ⅱ基因（ｘｙｎ２）高效表达的ｐｄｃ启动子，且里氏木霉分　泌的总蛋白中约８３％是ＸＹＮ２蛋白。ＷＡＮＧ等　利用　ｐｄｃ启动子调控康氏木霉纤维素酶转录激活因子ｘｙｒｌ　的表达，结果显著提高了纤维素酶的活性。ｐｄｃ组成型　启动子所构建的表达系统无需诱导物，能在富含葡萄　糖的培养条件下启动基因的转录。里氏木霉自身分泌　蛋白较少，能有效解决目的蛋白的分离及纯化问题。　本研究利用ｐｄｃ启动子实现了重构基因ｅｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—　ＣＤ哪在里氏木霉中的组成型表达，其ＣＭＣＮａ酶活达　到４．０８　Ｕ／ｍＬ，是出发菌株的５．５５倍，ＦＰＡ酶活达到　０．９１５　Ｕ／ｍＬ，较出发菌株提高了４３．６％，大大提高了酶　活力。　综上所述，重构基因ｃｂｈ２一ｌｉｎｋｅｒ—ＣＤ　在ｐｄｃ启　动子的调控下，实现了在里氏木霉中的组成型高效表　达，且杂蛋白较少，容易提纯。酶学性质研究表明，粗　酶液的最适ｐＨ为５．０，最适反应温度为５０　ｏＣ。ｃｂｈ２一　ｌｉｎｋｅｒ—ｃＤ　同时具有ｃｂｈ２和ｅｇ４的催化活性，在食　品、饲料、纺织等工业有着广泛应用前景。今后，我们　将对产酶培养基进行优化，通过改变对酶活影响较大　的３个因素（碳源、氮源、无机盐）来确定最优培养方　案，进一步提高该融合蛋白的酶活。今后将对该蛋白　进行纯化，并对其酶学性质做详细研究。　参考文献：　【１］邱雁临．纤维素酶的研究和应用前景［Ｊ］．粮食与饲料工业，２００１　（８）：３０－３１　［２１伯永科，崔海信．纤维素的循环经济效益［Ｊ］．中国资源综合利用，　２００６，２４（１　２）：１４－１６　［３】Ｓｕｎ　ＷＣ，Ｃｈｅｎｇ　ＣＨ，Ｌｅｅ　ＷＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃ－　ｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｒｕｔ　Ｃ－３０　ｏｎ　ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４３（１　ｏ）：１０８３－１０８７　【４】Ｍａｒｔｉｎｅｚ　Ｄ，Ｂｅｒｋａ　ＲＭ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｎａａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｍａｓｓ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｓｙｎ　Ｈｙｐｏｃｒｅａ　ｊｅｃｏｒｉｎａ）［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６：５５３－５６０　【５】Ｗｉｌｓｏｎ　ＤＢ．Ｔｈｒｅｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００８，１　１２５：２８９－２９７　【６］Ｆｏｒｅｍａｎ，Ｐ，Ｂｒｏｗｎ　Ｄ，Ｄａｎｋｍｅｙｅｒ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａ－　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｍａｓｓ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｆｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓ　Ｔｆｉｃｈｏ－　ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ，２００３，２７８：３　１９８８－３　１９９７　［７］７　Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ　Ｍ，Ｋｕｊａ－Ｐａｎｕｌａ　Ｊ，Ｙ１０ｓｍａｋｉ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒ—　ｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｂ＿ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ＢＧＬＩＩ（ＣｅｌｌＡ）［Ｊ１．Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８：　４５４６－－４５５３　［８］８　Ｓｉｎｇｈａｎｉａ　ＲＲ，Ｓｕｋｕｍａｒａ　ＲＫ，Ｐａｔｅ１　ＡＫ，ｅｔ　ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｏｌｉｄ—　ｓｔａｔｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ［Ｊ］．Ｅｎ－　ｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，４６：５４１－５４９　【９】Ｐｅｎｔｉｌａ　Ｍ，Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ　Ｐ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｈｏｍｏｌｇｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｅｌ－　ｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ：ｃｏｍｐｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ｉ　ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９８６，４５：２５３－２６３　【１０】Ｋａｕｒｉ　Ｔ，Ｋｕｓｈｎｅｒ　ＤＪ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔａｔ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌ－　ｌｕｌｏｓｅ［Ｊ］．Ｆｅｍｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｅｃｏｌ，１９８５，３１：３０１－３０６　［１　１］ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　（下转第１３８页）　刘登勇，等：红烧肉的传承、挖掘与提升　专息论述　—＝＝＝－１３８　【５】佚名．毛泽东一生中最喜欢吃的荤菜——红烧肉［Ｊ］．中国猪业，　２００８，３（３）：７５－７６　５Ｏ　【１８】赵节昌．如何做出高品质的红烧肉［Ｊ】．四川烹饪，２００５（５）：１６－１７　【ｌ９】马运哲，王兆华．厨艺讲坛（七）红烧肉篇——探寻红烧肉的“香”　招啊．四川烹饪，２００８（１０）：６９－７２　［６】永泰．毛泽东请门德斯品尝红烧肉叨．养猪，２０１０（３）：２７　【７】老鹏．是也！非也！红烧肉【Ｊ】．中国食品，２００６（６）：４７　【８］聂凤乔．“红烧肉”的量变与质变［Ｊ】．烹调知识，１９９５（５）：３６－３８　［９９］　李志胜．红烧肉的甜美意境【Ｊ】．科学养生，２０１　１（２）：１２　［１Ｏ】孙溥泉，孙健慧．为什么高脂饮食危害健康的理论不适合红烧　肉——谈谈红烧肉的烹调关键［Ｊ】．养猪，２０１０（４）：３９－４０　【１１】纪有华，路新国．红烧肉烹饪工艺及其影响因素研究［Ｊ】．扬州大　学烹饪学报，２０１０，２７（２）：３１—３６　【２０］ｈｏｎｇｋｕａｎｌ５．分子美食学——如何做出美味的红烧肉［Ｊ］．现代青　年（细节版），２０１　１（４）：７６—７７　【２１】孙向东．话说苏式红烧肉［Ｊ】．￣ｔ）ｌｌ烹饪，２００７（９）：８４—８５　【２２】林传和．红烧肉叨．食品与生活，１９９７（１）：３２—３３　［２３】王志远．沪派腐乳让红烧肉荡气回肠【Ｊ］．Ｉ￣ｔｌｌｌ烹饪，２００８（１０）：　７２－７３　［１２］陈忠明．华人基因中的红烧肉情结Ｌ刀．中国食品，２００８（２１）：２６－　２７　【２４】刘亮．给红烧肉的“营养”正名Ｕ】．烹调知识，２０１３（６）：７２　【２５】Ｅｓｔｅｖｅ　Ｍ　Ｊ，Ｆａｚｒ６　Ｒ，Ｆｒｔｇｏｌａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎｓ　Ｂ１，Ｂ２，　Ｂ６，ａｎｄ　Ｂ１２　ｉｎ　ｐｏｒｋ　ａｎｄ　ｍｅａｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｍｅａｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０ｏ２，６２（１）：　７３－７８　【１３】张少飞．响应面法优化红烧肉烹饪工艺研究［Ｊ］．食品工业，２０１３　ｆ７）：４—７　【１４】纪有华，王荣兰．红烧肉风味形成途径探讨【Ｊ】．扬州大学烹饪学　报，２００６，２３（２）：１９—２３　【１５】“ｕ　Ｔａｉｔｉ，Ｙａｎｇ　Ｔｓｕｎｇｓｈｉ，Ｗｕ　Ｃｈｕｎｇｍａｙ．Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｖｏｌａｔｉｌｅｓ　ｉｎ　ｓｏｙ　ｓａｎｃｅ－ｓｔｅｗｅｄ　ｐｏｒｋ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｌｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ａｎｄ　ｒｅｈｅａｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　［２６］ｖａｎ　Ｈｅｅｒｄｅｎ　Ｓ　Ｍ，Ｓｍｉｔｈ　Ｍ　Ｆ．Ｔｈｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｃｕｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｐ－ｃｌａｓｓ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｆｒｉｃａｎ　ｐｏｒｋ　ｃａｒｃａｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ－　ｉｓｔｒｙ，２０１３，１４０（３）：４５８．４６５　【２７】苟晓霖，张靖，邸晓光，等．烹调对猪肉中脂肪、脂肪酸的影响［Ｊ］．　中国烹饪研究，１９９７（１）：３６—３９　ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ａ　ｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ，２００１，８１（１５）：１５４７－１５５２　【１６】梅方．中国烹饪原理【Ｍ】．北京：高等教育出版社，１９８９：７－８　［２８】佚名．红烧肉如何制作与调味［Ｊ】．肉类研究，２００７（５）：５１—５２　收稿日期：２０１４—０２—２５　【１７］张伟力，刘晓飞．红烧肉材料选用与烹饪［Ｊ］．养猪，２００９，（５）：４９－　（上接第１１７页）　ｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ　ｎｄ　ａＭｉｃｒｏｂｉｌａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，３２：３５－４０　９８１８　［１２】ＬＩＵ　Ｇａｎｇ，ＴＡＮＧ　Ｘｉｎｇ，ＴＩＡＮ　Ｓｈｅｎｇｌｉ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｅｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｅｎｄｏｇｌｕｅａｎａｓｅ　ＩＶ　ｗｉｔｈ　ａｎ　［１７】Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏｈｕａ，Ｌｉｕ　Ｘｕａｎ，Ｘｉａｏ　Ｐｅｎｇ，ｅｔ　１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉａｏｎ　ａｎｄ　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ｕｓｉｎｇ　ａｎ　Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｅｂｈ１Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｎｄ　ａｔｈｅ　Ｎａｔｉｖｅ　ＣＢＨ　Ｉ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｄｕｓｔｉａｒｌ　ＦｕｎｇｕｓＴｒｉｃｈｏ－　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ［Ｊ］．Ｗｏｄｄ　Ｊ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００６，　２２：１３０１一ｌ３０５　ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１６５（５／６）：　１１６９－１１７７　【１３】Ｐｅｎｔｔｉｌ　Ｍ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ　Ｈ，Ｒａｔｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｍａ　ｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］．　【１８】Ｗａｎｇ　Ｂｉｎｇｂｉｎｇ，Ｘｉａ　Ｌｉｍｉｎｇ．Ｈｉｓｈ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｏｂｉｓｅ　ａｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｏｉ【Ｊ］．　Ｇｅｎｅ，１９８７，６１（２）：１５５—１６４　［１　４］乔宇，毛爱军，何永志，等．里氏木霉内切一Ｂ一葡聚糖酶Ⅱ基因在毕　赤酵母中的表达及酶学性质研究叨．菌物学报，２００４，２３（３）：３８８－　３９６　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１　ｌ，１０２（６）：４５６８－４５７２　【１９】Ｌｉ　Ｊｕｎｘｉｎ，Ｗａｎｇ　Ｊｕａｎ，Ｗａｎｇ　Ｓｈａｏｗｅｎ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔｒｏｎｇ　ｅｏｎｓｔｉｔｕ－　［１５］Ｈｉｍｍｅｌ　ＭＥ，Ｄｉｎｇ　ＳＹ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＤＫ，ｅｔ　ａ１．Ｂｉｏｍａｓｓ　ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｃｅ：　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｐｌｎｔａｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｒｆ　ｂｉｏｆｕｅｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｔｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ　２０１２，ｌ　１：８４　【２０】Ｗａｎｇ　Ｓｈａｏｗｅｎ，Ｌｉｕ　Ｇａｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｊｕａｎ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｕｌｓｅ　ａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＲＵＴ　Ｃ３０　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍａ—　２００７，３１５（５８１３）：８０４－８０７　［１６］Ｚｈａｎｇ　Ｊｉｗｅｉ，Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏｈｕａ，Ｚｈａｏ　Ｘｕｅｎａ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｇｅｎｅｓ【Ｊ】．Ｉｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２０１３．４０：６３３—６４１　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｂ—ｇｌｕ—　ｃｏｓｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔｒｏｎｇ　ａｒｔｉｉｆｃａｌ　ｅｅｌｌｏｂｉｏｈｙ－　ｄｒｏｌａｓｅ　１　ｐｒｏｍｏｔｅｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０１（２４）：９８１５－　收稿日期：２０１４—０３—１２