基于透明质酸构建的功能材料及其在生物医药领域中的应用

基于透明质酸构建的功能材料及其在生物医药领域中的应用

摘 要： 透明质酸（HA）是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺二糖重复单元组成的线性聚阴离子多糖。目前，HA的研究和应用主要体现在3个方面：（1）基于HA分子含有的羟基、羧基和乙酰氨基等官能团，制备各类衍生物和水凝胶；（2）基于HA分子能与癌细胞表面的受体（如分化簇44（CD44）、淋巴管内皮细胞受体1（LYVE-1）、HA内吞受体（HARE）和HA介导的运动受体（RHAMM）等）相互作用，将HA及其衍生物用作靶向药物治疗的药物载体；（3）基于HA与人体生理活动的密切相关性，发展HA水凝胶在组织工程等领域的应用。本文系统总结了以HA为原料，根据其独特的物化性质和生物学性能特点开发的生物材料的研究进展及其在癌症靶向治疗、伤口愈合、术后黏连、软骨再生和骨关节炎治疗等生物医药领域中的应用。

关键词： 透明质酸；功能材料；药物释放；组织工程；生物医药应用

透明质酸（HA）是在1934年由Meyer从牛眼玻璃体液中分离得到的一种多糖[1]。20世纪50年代Meyer等[2]确定了HA的分子结构，它是一种天然存在的聚阴离子多糖，其化学结构是由交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的二糖重复单元组成（图1（a））。在生理条件下，HA表现出弱酸性，但通常以钠盐的聚电解质形式存在，因此HA也被称为透明质酸钠。

在人体内，超过50%的HA存在于皮肤、肺和肠等器官中，也存在于滑液、脐带和血液中。研究表明，HA与细胞调节有很强的相关性，如细胞迁移和增殖等[3]。此外，HA在伤口愈合、血管生成和细胞间质构建等方面都发挥了关键作用[4]。HA具有较宽的重均分子量分布（1×106～1×109）[5]，高分子量的HA会被降解成小分子进入淋巴管、淋巴结、血液、肝脏和肾脏等组织[6]。不同分子量的HA在人体中的功能不同，高分子量HA与维持

细胞间质完整性和含水量密切相关，而低分子量HA与受体介导的细胞内信号传导密切相关[7]。许多研究报道了HA受体与细胞内吞作用、降解和信号传导等生理活动密切相关。HA受体主要有分化簇44（CD44）[8]、HA 介导的运动受体（RHAMM）[9]、HA 内吞受体（HARE）[10]和淋巴管内皮细胞受体 1（LYVE-1）[11]等类型。

HA除了与人体生理活动有强关联性外，还具有可降解性、非免疫性、黏弹性、靶向性和生物相容性等优点，在生物医药领域展现出广阔的应用前景[12]。在早期阶段，HA大多从人脐带和公鸡鸡冠中分离得到，主要作为眼科手术中玻璃体补充剂和治疗骨关节炎的黏弹性补充剂。近几十年，利用生物发酵技术已经实现HA的规模化制备，这使得HA被广泛应用于生物医药领域成为可能。然而，HA本身具有稳定性差和生物半衰期短等缺点，在一定程度上限制了其在生物医药领域中的应用[13]。通过化学修饰法制备HA衍生物，可以克服上述HA的不足之处，而且基于这些HA的衍生物可以制备凝胶[14]、纳米载体[13, 15]和杂化材料[16]等，应用于组织工程、靶向药物释放和疾病诊断等生物医药领域。

1 结构、合成与降解

HA是由一组高度特异化的膜蛋白HA合成酶（HAS）在质膜上合成的[3]。哺乳动物中含有3种HAS同工酶：HAS1、HAS2和HAS3，每种HAS同工酶含有2个不同的尿苷二磷酸 (UDP)-糖（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc））结合区域[17]。HA聚合过程（图1（b））发生在质膜的内表面，HAS交替地将UDP-GlcA和UDP-GlcNAc单体添加到聚合物的还原端。随着聚合过程的进行，糖链的非还原端通过HAS结构中的孔道转移到细胞外空间。研究表明，尽管这3种同工酶具有55%～70%的结构同一性，但它们合成HA的能力各不相同。对于UDP-GlcA和UDP-GlcNAc来说，HAS1较之于HAS2和HAS3具有更高的米氏常数（Km）和较低的HA合成速率[18]。另外，HAS1和HAS2能够产生高分子量的HA（分子量可达 2×106），而 HAS3

产生较低分子量的 HA（105～106 ）[18, 19]。因此，HAS 同工酶可能是对多种细胞行为进行有效调节的至关重要的精细控制系统。

图1 （a）HA 化学结构；（b）HA 合成示意图；（c）HA 降解示意图[20]

Fig. 1 （a） Chemical structure of HA; Schematic representation of （b）

biosynthesis and （c） biodegradation of HA[20]

HA的合成和降解受到严格的生理控制，不同组织中HA的半衰期差异很大，例如皮肤和血清中的HA半衰期小于1 d，而软骨中的半衰期长达14～21 d[20]。HA从细胞间质中去除主要是由于HA局部分解代谢或进入淋巴系统在区域淋巴结中分解代谢。HA可以被HA酶（HAase）家族中的许多酶分解代谢。透明质酸酶1（Hyal1）和透明质酸酶2（Hyal2）是两种最常见且最重要的HA酶，两种酶存在于几乎所有的体细胞组织中[21]。Hyal1以两种同种型酶存在，第1种是重均分子量为5.7×104的糖基化蛋白质，第2种是缺失了约100个氨基酸形成的重均分子量为4.5×104的糖基化蛋白质[22]。体内和体外研究都证实，较大的同种型酶可能是由细胞分泌的，而较小的同种型酶则在酸性细胞囊泡中

[23]。Hyal2

通常以与糖基磷脂酰肌醇（GPI）结合的形式固定在质膜的细胞外侧[24]。研究

表明，Hyal1和Hyal2通过协同作用来完成HA降解过程（图1（c））。与糖基磷脂酰肌醇结合的Hyal2在细胞外结合HA，随后内吞HA（可能通过HA受体内吞）并在酸性内吞囊

泡中对长链HA聚合物进行初步切割，而且Hyal1可以在β-外切糖苷酶的帮助下进一步分解这些囊泡中的HA寡聚体[25]。基因敲除研究证明了Hyal1的分解作用在很大程度上可以通过β-外切糖苷酶得到补偿，而Hyal2则可以使小鼠胚胎致死或产生严重缺陷[26]。除了酶促降解外，HA还可以在应激条件下由多种细胞产生的活性氧进行降解，借助各种损伤模型已经初步明确了超氧化物和过氧亚硝酸盐对HA的降解机理[20]。

2 在人体中的功能

HA结构中的亲水基团（如羟基、羧基和乙酰氨基）不仅可以形成分子间氢键，而且还能与水分子相互作用，从而赋予HA很好的亲水性能[27]。值得注意的是，与典型的亲水聚合物不同，HA含有由轴向氢原子形成的疏水区域（图2）。由于亲水基团和疏水基团共存于HA的主链上，因此HA具有独特的两亲性。当HA通过静脉注射到体内时，其半衰期只有几分钟，在血液循环期间即消失，大部分HA被运送至肝脏。HA通过内吞作用进入肝脏的肝窦内皮细胞并被降解，注射后20 min可在血液循环中检测到HA的降解产物。注射HA至皮肤和关节组织的半衰期（HA的半衰期为将其注射到各种组织后测定的半衰期）为12 h，眼前房为1～1.5 h，玻璃体为 70 d[3]。

尽管单独的HA具有独特的物理化学特性和生理功能，但是HA的生理功能主要是通过与受体蛋白（HABP）相互作用表现出来的。这些受体蛋白在组织表达、细胞定位、特异性、亲和力和生理调节方面表现出显著差异[28]。根据与HA的结合基序不同，HABP可大致分为：分化簇44、淋巴管内皮细胞受体1、HA内吞受体和HA介导的运动受体等[28]。通常，HA-蛋白受体相互作用所产生的细胞信号传导反应强烈依赖于HA分子量和细胞表型[29]。HA受体分布在人体肝脏、关节、眼睛和皮肤等器官中（图2），这些受体在HA的内吞和降解及调节细胞增殖、迁移和分化中发挥关键作用。其中，CD44是最受关注的受体，因为它在各种细胞中广泛分布。HA与CD44的结合与细胞黏附、细胞迁移、诱导造

血分化以及细胞信号传导激活等活动密切相关[30]。据报道，除了成纤维细胞和平滑细胞对生长因子的细胞反应外，HA与RHAMM的结合还能调节与内皮细胞增殖相关的血管生成

[31]。HARE和LYVE-1在受体介导的内吞作用和淋巴系统中HA降解均发挥着重要作用[10]。

由于HA受体在体内的广泛分布及其与生物组织的独特作用，HA已成功应用于药物输送和组织工程的靶向配体[32]。

图2 HA的化学结构和体内HA受体分布示意图[12]

Fig. 2 Schematic illustration of chemical structure of HA and distribution of

HA receptors in the body[12]

In the chemical structure,hydrophilic （blue） and hydrophobic （red）

moieties are indicated,and the hydrogen bonding is represented by green dashed

lines

3 化学改性制备 HA 衍生物和凝胶

HA可以作为眼科手术中的玻璃体补充剂和治疗骨关节炎的黏弹性补充剂，在生物医

药领域广泛应用。尽管HA已经成功商业化，但半衰期短的缺点严重限制了其进一步临床应用。对HA进行修饰或交联可延长HA在体内的存留时间，现在的合成策略主要通过对HA的羧基和羟基进行修饰或交联，包括HA的酯化[33]、碳二亚胺修饰HA[34]以及使用二乙烯基砜修饰HA[35]、缩水甘油醚或二醛交联HA[36]等。这些化学修饰的目的主要是根据特定应用条件和特殊要求来制备HA材料，同时尽量避免损失原始HA的生物相容性、生物降解性以及与细胞和其他生物组织等相互作用的性能。

图3为基于不同官能团修饰得到的HA衍生物化学结构示意图，化学修饰位点主要是HA的羧基。由于HA的羧基是HA受体和HA酶的识别位点，因此对HA的羧基修饰会改变HA在体内的生物学行为[37]。随着HA羧基修饰程度的增加，HA衍生物的降解速率下降[38]。HA可以被设计成含有各种官能团的天然高分子，如可以通过己二酸二酰肼（ADH）、六亚甲基二胺（HMDA）或胱胺与HA的羧基发生共轭反应来制备氨基修饰的HA[39, 40]。另外，HA的羧基可以和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）共轭制备具有活性官能团的氨基[41]。巯基修饰的HA可以通过HA羧基与胱胺的反应以及随后用二硫苏糖醇（DTT）断裂双硫键制备得到，还可以用HA与3-（2-吡啶基二硫代）丙酰肼（PDPH）反应，随后用碘乙酰胺断裂双硫键来制备巯基功能化的HA[42, 43]。同样地，多巴胺可以修饰HA制备HA-多巴胺衍生物。为了提高HA在DMSO中的溶解性，HA可以用离子交换树脂制备四丁基铵盐修饰的HA（HA-TBA）[44]。HA-TBA在DMSO中可以分别与甲基丙烯酸氨基乙酯（AEMA）、氨丙基甲基丙烯酰胺（APMAm）或乙烯基砜（VS）反应制得HA-AEMA、HA-APMAm和HA-VS衍生物[44, 45]。

图3 HA在水中或者DMSO中进行化学修饰制备各种HA衍生物的示意图[5]

Fig. 3 Schematic illustration of chemical modification of HA in water or in

DMSO for the preparation of various kinds of HA derivatives[5]

制备HA水凝胶的交联反应有3种类型：HA直接交联、HA衍生物交联以及两种不同HA衍生物之间的交联。根据二胺与HA羧基的物质的量之比不同，可以制备HA水凝胶或者氨基功能化的HA衍生物。如果二胺与羧基的物质的量之比远高于1/1，可将二胺接枝形成氨基功能化HA衍生物；相反，如果该值低于1/1，则二胺可用作交联剂形成HA凝胶。因此，可以采用此方案制备HA-ADH、HA-HMDA和HA-胱胺水凝胶。

除此之外，还可以通过向化学改性的HA溶液中加入交联剂进行交联反应制备水凝胶。HA-ADH、HAHMDA和HA-胱胺可以利用辛酸双（磺基琥珀酰亚胺基）酯作为交联剂进行交联[39]。具有双键的HA衍生物如HA-AEMA、HA-APMAm和HA-VS可以通过迈克尔加成与二硫醇（如二硫苏糖醇（DTT）和聚乙二醇（PEG）-二硫醇）或具有半胱氨酸基团的肽进行交联。具有硫醇基团的HA衍生物如HA-巯基（HA-SH）和HA-半胱胺可以使

用二硫苏糖醇和PEG-二硫醇进行交联。

制备HA水凝胶的另一种方法是混合两种不同的HA衍生物。如果一种HA衍生物的官能团与另一种HA衍生物的官能团反应，则可以简单地通过混合两种HA衍生物来制备HA水凝胶。迈克尔加成反应是制备HA水凝胶最常用的反应之一，主要是前体没有任何有毒副产物以及不需要任何额外的试剂。具有双键的HA衍生物可以与巯基功能化的HA衍生物进行交联反应，通过该方法可以在体内原位形成水凝胶。

另外，还可以通过冷冻解冻等物理方法制备HA物理凝胶。本课题组[46]通过对影响HA冷冻解冻凝胶过程中各种因素的研究，以及对所制备的凝胶性质的表征和分析表明，凝胶性质受冷冻解冻过程（冷冻时间和冷冻解冻次数）、HA分子量以及小分子添加物等多方面因素的影响。随着冷冻时间的延长或者冷冻解冻次数的增加，溶液中更多的自由链参与了物理交联的凝胶网络的形成，从而促进了其力学性能的提高。随着冷冻时间的延长，纤维网络结构及其密度相应增加，凝胶的热稳定性也相应提高。凝胶形成的机理为：在酸性和低温条件下，HA富集于高浓度的非冻结区域，更多的HA分子采取更易堆积的两重折叠分子构象，分子间通过多重氢键结合在一起。在酸性凝胶中，−COOH所参与的有效分子间氢键促进了凝胶三维网络结构的形成，而在中性凝胶中，分子间的相互作用主要是—COO−和—NHCOCH3之间的氢键（图4）。

图4 透明质酸冷冻解冻物理凝胶制备过程中的分子链不同状态示意图[46]

Fig. 4 Scheme for molecular states of HA chains during the preparation of HA

cryogel[46]

4 在药物释放中的应用

癌症已经成为本世纪严重危害人类健康的重大疾病之一，目前临床上普遍采用化学药物治疗，但是化疗药物缺乏选择性和靶向性，会对人体产生不同程度的毒副作用。为了克服当前癌症治疗中存在的这些问题，在过去几十年中，许多研究者致力于开发各种药物传递系统（DDS），旨在实现以肿瘤细胞为目标的药物传递和在病变部位的药物控制释放，通过被动和主动靶向模式将抗癌药运输到肿瘤部位来提高治疗效果并减少副作用[47-49]。在不同类型的DDS中，基于聚合物的DDS极具吸引力，例如胶束和聚合物囊泡纳米颗粒在生物相容性、生物降解性和稳定性方面比其他类型的纳米材料具有显著优势[49]。然而，同时将肿瘤环境敏感性、高载药量、优异的靶向能力和体内安全性等优势整合到一种基于聚合物的DDS中，仍然是一个巨大的挑战。由于HA易于化学修饰且对癌细胞具有靶向性，HA及其衍生物在药物释放领域已经成为一个极具发展前景的药物载体。如前面所述，细胞表面的多种受体中，CD44显得尤为重要，因为CD44涉及到表面受体与HA的相互作用、细胞增殖、特定细胞表面迁移、血管生成、细胞存活和HA的内吞作用等。此外，已经证明CD44受体会在许多肿瘤细胞表面过度表达，这些过度表达与肿瘤发生和肿瘤转移密切相关[50]。基于这种受体在癌细胞表面的过度表达，可采取受体介导的靶向策略用于肿瘤诊断和治疗。由于HA可以与CD44、LYVE-1、RHAMM和HARE等受体以非特异性方式结合，因此HA可以作为向细胞内递送抗癌药物的载体[51]。

HA主要是通过与药物或药物载体进行化学连接[52]（图5）而广泛应用于药物释放领

域。HA与药物结合形成复合物或者与药物载体（胶束和纳米颗粒等）结合，在药物释放中表现出诸多优势。首先，通过将药物与多糖直接结合可解决药物的溶解性问题。其次，HA可能会改善药物的血浆半衰期，减缓清除速率，起到与聚乙二醇相似的作用[53]；再者，由于HA增强的药代动力学特性，一些HA-药物复合物和HA-药物载体具有增强的渗透和保留（EPR）效应，从而提高肿瘤组织中的药物分布。最后，CD44在肿瘤细胞尤其是癌症干细胞或循环细胞中过度表达可以提高药物对癌症细胞的靶向性。

图5 HA 衍生物用于药物释放的示意图[54]

Fig. 5 Schematic illustration of HA and its derivatives fordrug delivery[54]

为了进一步提高化学药物治疗的特异性，可以采用纳米技术设计构造不同类型的刺激响应性药物释放系统（SDDS）。SDDS能够实现在特定位点和时间的药物释放，并能降低药物的毒副作用、增强其治疗效果[55]。药物的控制释放可以通过各种外部或内部的热量、溶剂极性、离子强度、生物大分子的作用、电/磁场或光的影响等来触发，如图6所示[56]。其中，pH、氧化还原和酶活性被称为内部刺激；光、磁场和温度等被认为是外部刺激。SDDS甚至可以响应不同刺激的多种组合，进一步提高其靶向和控制药物输送的特异性[56]。

4.1 HA 与药物形成络合物

Ringsdorf[57]首先提出制备大分子-药物络合物的方法并将小分子疏水性药物递送到靶向位点。这种药物释放系统主要包含水溶性的聚合物和共价连接的疏水性小分子药物。该方法的主要优点在于：（1）增加低溶解性或不溶性药物的水溶性，从而提高药物的生物利用度; （2）保护药物免于失活并保持其在循环过程中的活性;（ 3）最重要的是，它可以将药物递送到特定的肿瘤组织。

紫杉醇（PTX）是一种强效抗癌药物，主要用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、黑色素瘤、卡波西氏肉瘤和其他类型的实体瘤[58]。然而，由于PTX溶解性差且毒副作用大，使得PTX在抗癌方面的应用受到了一定限制。为了解决这一问题，在20世纪90年代后期有研究者尝试将PTX与HA结合，以期提高其化疗效果并减轻其副作用，结果表明HA载药量达到20%[59]。起初，这种结合药物主要用于治疗浅表性膀胱癌，后来发现其对过渡性膀胱细胞癌、卵巢癌和胃肿瘤的局部区域治疗均有积极作用。

喜树碱（CPT）是一种抑制DNA拓扑异构酶I的细胞毒性化合物。CPT难溶于水，而且在水中会打开内酯环产生水溶性的CPT羧酸盐，导致细胞摄取率低，因此会明显降低CPT的抗癌活性[60]。为了提高CPT的稳定性和溶解性，Fidia制药公司通过丁酸使CPT与HA结合，体外实验研究表明HA-CPT对几种不同的CD44细胞系表现出强烈的体外细胞毒性，而体内实验表明HA-CPT对结肠腺癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌和人肺癌具有明显的抗癌活性[61]。Xu等[62]以不同分子量的HA为原料，通过ADH与CPT连接制备HA-CPT，研究表明HA的分子量会影响络合物的水溶性和稳定性，但对络合物的抗癌活性没有影响。

图6 不同物理化学刺激响应性颗粒用于药物释放控制示意图[56]

Fig. 6 Schematic illustration of different physical and chemical stimuli exploited for triggering smart nanoparticles in controlled release of drugs[56]

多柔比星（DOX）是用于治疗癌症的最有效化疗药物之一，但同时也会对肾、肝和心脏产生严重的毒副作用从而使应用受到限制[63]。Cai等[64]开发了pH响应型的HA-DOX药物络合物。与静脉注射DOX治疗相比，肿瘤组织周围注射等效DOX剂量的HA-DOX可以产生有效的药物淋巴内递送和抑制肿瘤生长。此外，组织学研究表明注射HA-DOX后注射部位没有炎症或坏死。为了进一步调节DOX的释放量，HA-ADH被硫醇基团修饰，HA-ADH水溶液发生自凝胶化[65]。在pH和还原双重响应模式下，DOX持续从凝胶中释放，这种方法对卵巢或胃癌的局部区域治疗效果较好。

顺铂（CDDP）是一种重要的含铂抗癌药物，铂类抗癌药还有卡铂和奥沙利铂。在临床上，CDDP用于治疗不同类型的癌症，包括肉瘤、软组织、骨骼、肌肉和血管的癌症。虽然铂类具有高效的抗癌活性，但它的剂量依赖性副作用（包括肾毒性、神经毒性和骨髓抑

制等）已经严重限制了铂类抗癌药的应用。为了降低铂类抗癌药毒性并增加其在肿瘤部位药物释放量，研究者已经设计了几种合成HA-CDDP络合物的方案。与标准CDDP制剂相比，HA-CDDP络合物的淋巴管内递送不仅显著增加了局部区域结节组织中的药物浓度，而且表现出持续释放动力学，肝脏、脾脏和肾脏中的药物摄取量增加[66]。另外，研究还报道了HA-CDDP在过表达CD44非小细胞肺癌的体外模型中的选择性抗癌作用。在最近的体内研究中，当在局部晚期的头颈部鳞状细胞癌中给予制剂时，HA-CDDP抗肿瘤功效显著提高并且毒性降低[67]。

4.2 有机纳米材料

4.2.1 HA胶束药物释放 两亲性多糖胶束已被广泛用于递送水不溶性抗癌药物，因为它们具有较小的粒径、核-壳结构、高溶解性、良好的体外稳定性、EPR被动靶向效应、靶向性以及延长的循环周期[68]。设计胶束结构可以将热敏感或pH敏感组分添加到自组装共聚物结构中，通过控制外部或内源刺激释放药物。水溶性差的药物可以通过物理方式嵌入或共价连接到聚合物主链上，改善药物的生物利用度，实现药物持续释放和降低药物毒副作用。许多因素均会影响胶束的性质，主要包括结构中亲水部分与疏水部分的比例、颗粒大小以及药物与共聚物的相容性等[69]。虽然胶束有助于增加药物的水溶性，但它们也存在药物负载量小、包覆效率低和体内稳定性差等局限性。因此，必须选择具有某些特定性质的共聚物来制备多功能聚合物胶束克服这些限制。基于HA的胶束载药体系引发了研究人员的广泛兴趣，HA一方面可作为形成胶束外壳的亲水性聚合物，另一方面可赋予胶束CD44癌细胞的靶向性。

通过物理或化学方法包覆药物的纳米载体具有“增强的渗透性和保留（EPR）效应”，能够将药物有效运送至肿瘤部位[70, 71]。为了利用EPR效应，纳米载体需要长时间停留在体循环中才能渗入肿瘤组织，这对于肿瘤靶向运输至关重要。与单纯的HA胶束相比，PEG

修饰的HA胶束能更好地聚集在肿瘤部位[72]。然而，由于药物存在于纳米颗粒内部，导致其在肿瘤部位释放效率低下，成为纳米颗粒药物发挥功效的最大障碍[70]。为了克服这一障碍，可以通过设计刺激响应性纳米药物载体，利用温度、超声、光、磁和电化学等外源刺激，触发药物从纳米载体中高效释放[48]。另外，基于肿瘤病理生理学表现出的特征变化，如pH、酶活性或氧化还原性质，可作为内部刺激来加速药物释放[73]。

众所周知，癌细胞的生理pH低于血液和正常组织的pH，细胞内早期溶酶体和晚期溶酶体中的pH分别约为6.0和5.0。因此，通过利用肿瘤中的酸性微环境，可以设计pH响应性药物递送系统用于细胞外和细胞内药物释放，主要有以下3种不同机制：（1）通过引入可质子化基团；（2）载体聚合物含有酸敏感的化学键；（3）pH响应型“PEG脱离”，最终实现可在细胞外或细胞内低pH下促进细胞摄取和细胞内药物递送（图7）[70]。

图7 肿瘤部位pH响应型药物3种释放途径示意图[70]

Fig. 7 Schematic illustration of three pathways for pH-triggered targeted drug

release at the tumor[70]

Conformational changes promoting internalization due to （1） protonation

or （ 2） extracellular drug release due to dissociation or （3） PEG

detachment

HA可通过其羧基与聚（L-组氨酸）（PHis）（pH敏感型的聚合物）的氨基官能团连接，通过自组装并负载抗癌药物（DOX载药率4%～6%）形成具有肿瘤靶向的共聚物（HA-PHis）。由于PHis能够在酸性条件下质子化，使得HA-PHis共聚物在其结构中含有pH响应性嵌段，包覆的DOX能够在癌细胞（较低的pH）中加速释放（图8）[74]。研究者基于这一结构进一步设计了HA-PHis和D-α-生育酚（PEG 2000）构成的pH敏感型共聚物用于包覆和释放DOX，以期克服DOX的多药耐药性。与负载DOX的HA-PHis胶束载药系统相比，这种载药系统（载药率10%）对乳腺癌MCF-7细胞表现出强细胞毒性。小鼠体内实验显示，在肝脏和肿瘤中均积聚了胶束，而且其浓度随时间逐渐增加[75]。

图8 自组装的HA-PHis胶束和pH敏感型的药物释放系统示意图：（a）DOX包覆的HA-PHis；（b）通过EPR效应载药颗粒聚集在肿瘤细胞内；（c）通过CD44介导细胞

内吞运输到细胞质，并在细胞质内加速释放，提高释放量和抗癌效率[74]

Fig. 8 Schematic illustration of self-assembly HA-PHis micelles and pH-responsive intracellular drug delivery: （a） DOX-encapsulated micelles based on HA-PHis copolymers are formed in aqueous condition;（b） Particles of suitable size promote nanocarrier accumulation in tumor tissue by the EPR effect;

（c） Micelles are selectively taken up by tumor cells via CD44 receptor-mediated endocytosis and delivered to the lysosomes,triggering the release of DOX into the cytoplasm,improving intracellular drug release and increasing the antitumor

efficacy[74]

Zhong等[76]基于HA-树突寡聚甘油设计开发了一种新型pH敏感的紫杉醇前药胶束（HA-dOG-PTX-PM），并用于治疗CD44过表达的人乳腺癌。HA-dOG-PTX-PM具有较高的载药量和较小的颗粒直径，可以实现PTX在pH 7.4条件下缓慢释放，以及在酸性条件下加速释放，而且这种胶束对过表达CD44受体的MCF-7人乳腺癌细胞具有靶向性。HA-dOG-PTX-PM在裸鼠体内具有较长的循环时间并且在MCF-7肿瘤中具有较高的积累量，可以有效治疗MCF-7人乳腺肿瘤。因此，负载PTX的pH敏感型HA胶束在治疗CD44癌细胞方面具有巨大的潜力。

近年来，设计还原敏感型胶束并用于药物释放也引起了研究者的广泛兴趣[77]。这些还原敏感型胶束通常在主链、侧链或交联剂中含有特征性的二硫键（SS），在轻度氧化的细胞外环境中二硫键相当稳定，而二硫键在还原性条件下易于通过硫醇-二硫键交换反应在细胞内快速裂解[78]。谷胱甘肽（GSH）在细胞溶质和亚细胞区室中以毫摩尔浓度存在（2～10 mmol/L），而在人血浆中浓度较低（约2～20 μmol/L）。细胞外和细胞内环境GSH浓度的显著差异是设计还原敏感型胶束的前提。此外，与正常组织相比，肿瘤组织是高度还原型环境，肿瘤细胞质中GSH浓度比正常细胞高几倍，使得还原敏感型胶束可用于肿瘤特异性药物和基因释放[77]。

基于还原敏感型的HA-脱氧胆酸（HA-SS-DOCA）络合物成功用于紫杉醇（PTX）的靶向细胞内递送（图9）[15]。该络合物在水性介质中自组装成纳米级胶束，对PTX表现出优异的载药率（34.1%）和包覆率（93.2%）。HASS-DOCA胶束在正常生理条件下可保持

稳定，但在20 mmol/L还原剂谷胱甘肽存在下能够快速分解。HA-SSDOCA胶束通过HA受体介导的内吞作用被摄取到人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）。与不敏感对照组相比，载有PTX的HA-SS-DOCA胶束具有更强的细胞毒性、更高的细胞内药物释放速率和肿瘤靶向能力。 Zhong课题组[79]研究报道了由HA-b-聚（三亚甲基碳酸酯-二硫戊环三亚甲基碳酸酯）二嵌段共聚物自组装形成的新型HA二硫化物交联的可生物降解聚合物胶束（HA-XPS），并用于抗体药物（mertansin毒素，DM1）的释放。HA-XPS对DM1具有较高的载药量和较低的粒径（约80 nm）。在生理条件下，纳米颗粒的药物渗漏量低；而在肿瘤细胞内，纳米颗粒具有快速还原响应性从而导致药物快速释放。体内实验证明HA-XPS-DM1具有高效抗癌效果，为CD44过表达的恶性肿瘤治疗提供了一种新颖独特的方法。

图9 还原敏感型的HA-SS-DOCA胶束自组装、肿瘤聚集以及胞内运输示意图[15]

Fig. 9 Illustration of the self-assembly,accumulation at tumor tissue and intracellular trafficking pathway of redox-sensitive HA-SS-DOCA micelles[15]

在纳米胶束的结构设计中同时引入两种具有刺激响应性的化学结构，即可获得具有双重响应型的纳米胶束载体，在研究中最为常见的是pH/还原双重响应体系。pH/还原双响应型可生物降解的胶束能够同时在酸性条件下和还原性细胞质中引发药物释放，从而产生优异的抗肿瘤效果。例如，通过将磷酸胆碱和DOX化学接枝到HA骨架上制备具有pH和还原双重响应性的仿生HA前药胶束[80]。通过对pH敏感的腙键将DOX与HA连接，该胶束可在酸性条件下断裂，从而释放DOX。HA前药胶束通过二硫键交联以改善胶束的稳定性。在CD44受体高表达的MDA-MB-231细胞系中观察到较高摄取量的DOX。这种pH/还原双响应型胶束可以增强对癌细胞的选择性抑制并为癌症治疗提供有利平台。另外，双重响应型HA胶束可以通过将疏水性6-巯基嘌呤（MP）接枝到硫醇HA，HA胶束可以作为将DOX递送至结肠癌细胞的药物载体[81]。药物释放研究结果显示，在GSH存在下，pH 5.0下的药物释放量高于生理pH下的释放量。离体生物分布研究表明，负载DOX的HA-SS-MP胶束在肿瘤区域比在任何其他器官中累积更多。体内实验结果表明，负载DOX的HA-SS-MP胶束在抑制裸鼠的肿瘤生长方面表现出比游离药物更好的治疗效果。

4.2.2 脂质体 脂质体作为靶向药物的载体运送药物至特定细胞已经受到了广泛研究，并且在提高抗肿瘤功效方面取得了巨大发展。DOX脂质体形式的药物例如Myocet®或Caelyx®（Doxil®）已经上市[82, 83]。与游离DOX相比，脂质体形式的DOX具有高效的抗肿瘤效果。脂质体作为药物释放载体主要有3个方面的优势：（1）可以分别在脂质双层和水性核中包覆亲脂性和亲水性活性药物；（2）基于天然化合物构建的脂质体具有高度的生物相容性和生物降解性，并且表现出低毒性和低免疫原性[84]；（3）脂质体作为多功能的囊泡，可通过调节其结构特别是表面结构来控制腔内药物释放的途径[85]。

HA修饰的脂质体用于靶向CD44表达细胞的药物释放研究主要集中在选择性递送抗肿瘤药物（小分子或大分子）[86]。通过两种基本方法可以将HA嵌入到脂质体膜上：（1）利用HA的羧基与脂质体上的氨基形成酰胺键，可以将HA有效包覆到脂质体表面，但必

须在每批次上进行包覆，相当耗时[87]；（2）将低分子量的HA嵌入到双分子层中形成HA修饰的脂质体[88]。如磷脂酰乙醇胺（PE）、二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE）或二羟甲酰基甘油磷脂酰-sn-甘油-3-乙醇胺（DiPhPE））的氨基均能够与HA的羧基形成酰胺键，从而将HA与脂质连接，采用该方法可以快速制备HA修饰的脂质体。

Park等[87]制备了由两亲性HA-神经酰胺（HACE）包覆的纳米杂化脂质体，用于靶向递送抗癌药物和体内成像试剂。与生理pH（7.4）相比，在酸性（pH为5.5和6.8）条件下，脂质体中DOX的释放速率明显提高，通过HACE包覆纳米杂化脂质体的外表面来减少由空白脂质体产生的细胞毒性。与普通脂质体相比，HA和CD44受体相互作用增强了DOX的细胞摄取。在大鼠的药代动力学研究中，纳米杂化脂质体明显降低了DOX的体内清除率，表明药物在血液中循环时间延长并且治疗功效提高。

同样地，Jiang等[89]制备了具有pH响应性多肽和靶向HA的双功能化的脂质体用于肿瘤靶向药物递送（图10）。通过疏水作用将硬脂酰（R6H4）固定在脂质体表面，构建R6H4修饰的脂质体（R6H4-L）。进而通过静电效应屏蔽R6H4-L的正电荷构建HA功能化的R6H4-L，以保护脂质体免受血浆蛋白的侵袭。在HA酶处理后，负载紫杉醇的HA-R6H4-L（PTX/HA-R6H4-L）对肝癌细胞（HepG2）显示出更强的细胞毒性。体内成像表明，当用过量的HA预处理小鼠时，近红外染料15（NIRD15）负载的HA-R6H4-L（NIRD/HA-R6H4-L）在肿瘤部位的积累量减少，说明脂质体是通过HA与CD44相互作用，从而使PTX/HA-R6H4-L对鼠肝癌（Heps）肿瘤异种移植模型具有高效的抗肿瘤效果。

图10 PTX/HA-R6H4-L 脂质体的制备及用于药物释放示意图[89]

Fig. 10 Schematic illustration of the dual-decorated liposomes PTX/HA-R6H4-L for tumor-targeted drug delivery[89]

尽管低分子量HA本身能促进血管生成而且会引发炎症，但研究表明用不同分子量HA修饰的脂质体对过度表达CD44的肿瘤细胞增殖无明显影响[90]。这些纳米载体似乎不会引起巨噬细胞活化，而且无论包覆脂质体表面的HA分子量多大，均未观察到细胞因子诱导。因此，HA修饰的脂质体药物载体具有较高的生物相容性。

4.3 纳米颗粒

纳米颗粒是一类不均匀的载体，它们都具有共同的亚微米尺寸，但在组成、结构、制备方法和基质降解方面各不相同，已被广泛研究用于药物递送和成像，主要功能包括控制药物释放、防止降解、增强生物利用度和更好的药代动力学特征、靶向释放以及更高的药理学功效。基于纳米粒子的PTX配方（Abraxane®）已经上市，尽管它们的毒性低于常规疗法，但载药纳米颗粒仍然会导致不良反应。为了进一步增强纳米载体的抗癌活性并减少副作用，现在已经广泛用HA作为靶向剂[91]。许多研究报道了使用HA将纳米颗粒靶向于过度表达CD44的癌细胞，并且增加载体血液循环半衰期。获得HA基纳米颗粒的主要方

法有：HA修饰的纳米颗粒和基于HA的纳米凝胶。

4.3.1 HA修饰的纳米颗粒 聚合物纳米颗粒可作为抗癌治疗中的药物载体，在某些条件下表现出更强的体内稳定性。由于聚合物种类丰富，纳米颗粒制备方法多样，而且许多合成和天然聚合物具有生物降解性，因此聚合物纳米颗粒作为一类安全的药物载体在药物释放中得到了广泛应用。特别是，脂肪族聚酯与HA结合用于药物释放最为常见，如聚丙交酯（PLA）、聚（丙交酯-co-乙交酯）（PLGA）、聚己内酯（PCL）和聚（丁基氰基丙烯酸酯）（PBCA）。将PLGA和HA连接可以获得具有两亲性的HA-PLGA聚合物，它们能够形成具有核-壳结构的纳米颗粒，其中亲水性HA形成纳米颗粒的外壳，而疏水性PLGA形成内核。当这种聚合物纳米颗粒用于负载DOX时，其载药量高达11.7%，实验表明聚合物颗粒是通过受体介导的内吞作用选择性摄取到CD44过度表达的HCT-116细胞[92]。miR-542-3p是靶向肿瘤抑制因子p53和凋亡抑制剂survivin的有效肿瘤抑制分子。Wang等

[93]开发了

HA修饰的聚乙烯亚胺-聚（D,L-丙交酯-共-乙交酯）（PEI-PLGA）纳米颗粒系统

用于靶向递送多柔比星（DOX）和miR-542-3p来治疗三阴性乳腺癌（TNBC）。该纳米颗粒可以有效防止miR-542-3p在血清中的降解。HA/PEI-PLGA纳米颗粒具有在组合TNBC疗法中共同递送化学药物和肿瘤抑制性miRNA的潜力，可提高MDA-MB-231细胞的药物摄取量。

多中心点是商业中心点、市场、大公园、小游园、文化遗迹等多个有特色的中心点。中心点作为城市活力的象征、人流聚集地的存在，也是城市形象的重点打造区。

4.3.2 基于HA的纳米凝胶 纳米凝胶是具有高含水量的纳米级网络，属于软性给药系统，通常具有生物相容性和稳定性，还可以通过与各种分子连接进行化学修饰[94]。在纳米凝胶中，亲水聚合物可以通过物理或化学作用进行交联。物理交联的纳米凝胶由聚合物链之间通过非共价力（氢键、疏水作用和离子键）形成，而化学交联的纳米凝胶由聚合物通

过形成共价键相连接形成，具有较高的稳定性[95]。

Jain等[96]制备了含有5-氟嘧啶（5FU）的HA-壳聚糖纳米颗粒（HACTNP）用于靶向治疗结肠肿瘤。通过离子凝胶法制备负载5FU的壳聚糖纳米粒子，再使用化学法制备HA包覆的壳聚糖纳米颗粒。与未偶联HA的壳聚糖纳米粒子（CNTPs）相比，装载5FU的HACTNP制剂具有更高的细胞摄取量，并且对HT-29细胞系具有更强的细胞毒性。另外，Jain等[97]还制备了含有奥沙利铂的HACTNPs，用以研究在小鼠结肠肿瘤模型中口服给药后的体内抗癌活性和体内生物分布。HACTNPs可以将药物有效运载至肿瘤部位，与CNTPs或游离奥沙利铂相比具有更有效的结肠肿瘤治疗效果。同样地，HA和壳聚糖可通过自组装形成聚离子纳米复合物，进而基于静电相互作用包覆带正电荷的DOX和带负电荷的microRNA-34a（miR-34a），用于治疗三阴性乳腺癌（图11）。HA与壳聚糖偶联形成颗粒，而非偶联到纳米颗粒的表面。这两种药物在体外和体内均产生协同抗肿瘤作用[98]。

5 HA 及其衍生物在生物医学中的应用

HA作为人体组织的主要成分之一，在组织工程中的应用受到了高度关注。HA在室温下具有高度溶解性，并且具有高降解速率，其降解速率主要取决于分子量和在人体内的分布位置。然而这些性质可能成为制造HA支架和保持结构完整性的障碍。为了克服这些障碍，往往需要对HA进行化学修饰和交联[14]。通过对HA的羧基和羟基化学修饰可获得HA衍生物，这些衍生物在细胞存在下进行交联，可用于软骨再生、伤口愈合以及骨关节炎治疗等。

图11 HA-壳聚糖纳米凝胶制备并用于递送DOX和miR-34a至肿瘤细胞示意图[98]

Fig. 11 Schematic illustration of the construction of HA-CS-based nanosystem for the simultaneous co-delivery of DOX and miR-34a to human breast cancer

cells[98]

5.1 软骨组织工程

关节软骨是关节的骨表面，它是一种复杂的活组织。关节软骨的主要功能是提供低摩擦表面，使得关节能够在进行日常活动和运动所需的不同运动范围内承受压力。然而，关节软骨很少或没有自我修复能力，任何损伤都需要手术干预。这可能是由于软骨细胞的增殖潜力有限以及它们对病理介质的分解代谢反应和无血管性质阻止了再生细胞的迁移[99]。现有技术如微骨折、镶嵌成形术、自体软骨细胞移植和骨软骨同种异体移植治疗软骨缺损是缓解疼痛和改善关节功能的主要方法，但这些方法生产的软骨通常由I型胶原组成，在化学性能和力学性能方面不如透明软骨。软骨组织工程的基本原理包括：（1）分离可在体外扩增的细胞；（2）封装在3维基质中进行增殖或与原位凝胶系统混合；（3）植入/注入损伤部位（图12）[99]。细胞可以通过培养原代自体/异源软骨细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞获得，支架必须具备可提供初始力学强度以及保留细胞浸润、增殖和分化以响应信号

分子和机械刺激等性能。软骨细胞具有高度环境特异性，并且已观察到整联蛋白受体与软骨细胞的相互作用导致产生细胞外分子如II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖[99]。

图12 软骨组织工程示意图[116]

Fig. 12 Schematic representation of cartilage tissue engineering[116]

Burdick等[100]研究表明软骨细胞可以在光交联的HA网络上生长，在多孔网络中产生软骨。Jin等[101]合成了由葡聚糖-酪胺结合物（Dex-TA）改性的HA，可作为可注射水凝胶应用于软骨组织工程。与单纯的Dex-TA水凝胶相比，在HA-g-Dex-TA水凝胶中培养的牛软骨细胞具有更强的繁殖能力，该水凝胶作为软骨组织工程的可注射支架具有很强的应用潜力。同样地，基于HA和聚乙二醇形成的可注射水凝胶也可用于软骨组织工程[102]。当软骨细胞与前体溶液混合时，交联后获得具有均匀细胞分布的水凝胶。体外实验显示软骨细胞存活并且发生细胞分裂，凝胶细胞基质在约21 d内降解，在第21 d，糖胺聚糖和II型胶原在水凝胶中积累。

人胚胎干细胞（hESCs）可作为提供软骨细胞的来源，hESCs在选择性生长因子存在的条件下衍生得到可扩增的软骨细胞，用于软骨修复和再生。Toh等[103]研究表明hESCs

衍生的软骨细胞在HA基水凝胶中培养时产生细胞外基质（ECM）富集的软骨组织（图13）。在软骨缺损模型中，hESCs衍生的软骨可形成细胞工程软骨（HCCEC），这些HCCEC在84 d内进入软骨组织进行有序重建，并与相邻宿主软骨完全整合；同时，移植的hESCs衍生的软骨细胞具有维持长期生存的能力且没有致瘤性风险，此结果表明HA水凝胶提供了一种安全、高效和实用的生物基材料用于软骨组织工程。

图13 软组织再生过程中HCCEC重塑过程的MicroCT模型[103]

Fig. 13 Illustration of MicroCT model of HCCEC remodeling process in

cartilage regeneration[103]

(a) 3D geometry of the implant site. Cross-sectional view of the implant site and its surrounding native tissue is obtained along the line AA；(b) Cartilage (yellow) and bone growth (grey) within the HCCEC implant were isolated out in micro-CT models,and compared to the native unoperated control. The host

cartilage and bone are denoted pink and blue respectively.

5.2 伤口愈合

皮肤作为人体最大的器官，可以保护身体免受微生物、感染、高温和辐射等方面的危

害。燃烧、伤害、刮伤或刺伤等损伤通常会使皮肤产生不规则形状。虽然轻微的伤口可以在没有治疗的情况下愈合，但是发生严重的伤害时，例如真皮层和下面组织产生缺陷，皮肤不会自愈合而且还需要额外治疗。许多研究采用制备生物材料用于伤口愈合，特别是基于聚合物的水凝胶，因具有高含水量（超过90%）而作为伤口愈合的敷料引起了很多关注

[104]。HA

是一种重要的糖胺聚糖（GAG），存在于许多人体组织的细胞外基质中，包括皮

肤、结缔组织和神经组织。HA可参与伤口愈合过程中的许多步骤，包括炎症和表皮再生。在伤口愈合的早期阶段，HA提供了一种基质来帮助成纤维细胞和内皮细胞的重组、增殖和迁移。此外，HA在伤口愈合过程中能够促进血管生成。有趣的是，各种研究证明HA在胎儿无疤痕愈合中起关键作用。综上所述，基于HA水凝胶的生物材料在促进皮肤伤口愈合方面具有广阔的应用前景[105]。

Kirket等[106]开发了一种腙交联的HA水凝胶薄膜，可显著促进表皮再生。研究发现，包含胶囊化促血管生成血管内皮生长因子质粒（pVEGF）的HA化学交联水凝胶，在糖尿病小鼠伤口愈合模型中表现出促进伤口快速愈合的能力[107]。但是，这些化学交联的HA水凝胶缺乏可塑性和自我修复的动态性质，无法填充不规则形状伤口。最近Shi等[108]制备了动态金属-配体用于制造具有自修复特性的可塑性超分子HA水凝胶（图14）。为了实现HA分子链的可逆交联，利用碳二亚胺偶联和点击反应制备双膦酸盐（BP）修饰的HA，向含有BP基团的HA溶液（HA-BP）中添加银离子（Ag+）便可立即形成水凝胶（HA-BP-Ag+）。与此前其他基于HA的水凝胶相比，HA-BP-Ag+水凝胶非常适合临床应用，因为可以填充不规则形状的伤口缺陷而无需预先成型。HA-BP-Ag+水凝胶对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株均具有抗菌特性，可预防伤口护理中的感染。通过大鼠全层皮肤伤口模型的体内评估显示，与未经治疗的对照组相比，治疗组的伤口残留率显著降低并且再生表皮层更厚。这种具有即用特性的可模塑和自愈合超分子HA水凝胶在伤口愈合上表现出巨大的应用潜力。

图14 （a）HA-BP 的合成示意图；（b）HA-BP-Ag+的合成示意图；（c）HA,HA-BP,Ag+的 UV-Vis谱图[108]

Fig. 14 （a）Schematic illustration of synthesis of HA-BP derivative; （b） Schematic illustration of synthesis of HA-BP-Ag+; （c） UV-Vis spectra of native

HA,HA-BP,free Ag+ ions,and mixtures of different HAs with Ag+ ions[108]

Wang等[109]报道了一种新合成的伤口愈合制剂（REG），将其嵌入在HA基水凝胶敷料中用于增强急性切除伤口的修复。HA基水凝胶主要利用二苯并环辛基官能化的HA与4-臂聚（乙二醇）叠氮化物，通过无铜点击化学交联制备。HA基水凝胶含有REG肽（一种红细胞分化调节剂），具有高效的细胞刺激能力，可持续释放生理活性肽。HA有助于伤口愈合，再加上HA基水凝胶中的REG，可以加速皮肤伤口愈合。REG-HA凝胶不仅提高了伤口愈合率，而且提高了胶原蛋白沉积量，同时提高了微血管的形成。因此，嵌入活性

肽的HA基水凝胶有望作为一种新型的伤口敷料用于治疗不同类型的伤口。

5.3 术后防黏连

黏连是由广泛的间质液渗漏引起的纤维蛋白交织引起的，常见于手术切口、创伤和其他病理情形中[110]。当富含毛细血管的颗粒组织逐渐取代坏死组织时，原位形成纤维蛋白网络，最终可导致纤维蛋白黏连和随后的组织功能障碍。一般而言，在损伤后3 h内形成纤维蛋白的胶体基质，标志着肉芽组织浸润的开始。成纤维细胞和巨噬细胞与纤维蛋白基质一起聚集到局部受损组织，在1～3 d形成肉芽组织[110]。随后第4 d成纤维细胞和巨噬细胞数量的增加有助于形成纤维蛋白网络。在损伤后大约14 d，在原位形成纤维黏连，同时网络中的大多数细胞消失。手术后腹膜黏连可能引起慢性疼痛、不孕、甚至致命的肠梗阻

[111]，是十分常见且严重的并发症。在先前剖腹手术患者的临床和尸检研究中，腹腔内黏连

的发生率高达90%。体内黏连主要包含肌腱黏连、心包黏连、腹部黏连、硬膜黏连和宫内黏连等（图15）[110]。

图15 组织黏附示意图[110]

Fig. 15 Illustration of tissue adhesion[110]

防止黏连的常用策略在于治疗受损组织或生物材料。基于组织治疗的方法涉及切断黏连形成过程，特别是通过减轻局部组织的炎症和渗出，抑制纤维蛋白的沉积和凝结以及保护伤口表面免受摩擦。作为产生纤维蛋白和引发组织过度生长的主要细胞类型之一，成纤维细胞是抗黏连治疗的目标，在临床实验中也广泛研究了如何抑制这些细胞的生成。基于生物材料的方法通常利用材料的物理和化学性质来实现抗黏附，生物材料作为抑制黏附形成的物理屏障或生物活性剂。许多局部或全身性抗炎药和抗凝药，包括阿司匹林、地塞米松和肝素，在预防术后黏连上都没有达到令人满意的临床效果[112]。物理屏障系统常用于防止黏连，主要有聚合物溶液、预成型固体片和水凝胶等[113-115]。其中一些已经商品化，如HA溶液（Sepracoat®，Genzyme，Cambridge，MA）、氧化纤维素（Interceed®，ETHICON Women's Health and Urology，Somerville，NJ）和 HA 钠-羧甲基纤维素膜（Seprafilm®，Genzyme，Cambridge，MA）[116]。然而，对于聚合物溶液，如 N,O-羧甲基壳聚糖（NOCC）、HA和羧甲基纤维素（CMC）的功效持续时间都很短。对于固体阻挡片，实现受伤表面完全覆盖是比较困难的，操作上也很难将这些材料固定到受损组织上，从而影响其预防黏连的有效性。

可注射的原位交联水凝胶系统受到了广泛关注[106, 116-118]，许多基于HA的交联水凝胶已被用作阻止黏连的屏障。然而，相对较长的胶凝时间是不切实际的[119]。此外，一些保留相当长时间（超过7 d）的水凝胶也可能危及腹膜伤口的愈合过程[120]。因此，开发一种安全、有效、便于给药且具有适当体内保留时间的抗黏连剂仍是一个巨大的挑战。Li等[116]报告了一种由羧甲基壳聚糖（NOCC）和醛基功能化的HA（A-HA）制备的可注射、可生物降解和无毒的水凝胶。通过将羧甲基引入壳聚糖的N-位和O-位来制备NOCC，并使用高碘酸盐氧化法制备A-HA。凝胶化主要是利用NOCC的氨基与A-HA中的醛基之间发生Schiff碱反应。NOCC、A-HA和NOCC/A-HA水凝胶表现出非常低的细胞毒性和溶血性，

急性毒性实验也表明水凝胶是无毒的。高度多孔的3维水凝胶有利于包裹在水凝胶中的细胞生长和增殖，不利于成纤维细胞附着到表面，这表明可以开发NOCC/A-HA水凝胶用于防术后黏连。此外，他们采用侧壁缺损-盲肠磨损大鼠模型来研究NOCC/A-HA水凝胶在预防术后腹膜黏连中的功效。与HA水凝胶和生理盐水组相比，在NOCC/A-HA处理组中腹膜黏连显著减少。Amano等[121]制备了3价铁离子螯合的HA衍生物水凝胶。先利用亚氨基二乙酸（IDA）修饰HA获得HA衍生物（HA-IDA），其修饰程度为其二糖单元HA的22%，而且HA-IDA具有与HA几乎相同的降解速率。HA-IDA通过与铁离子（Fe3+）交联形成水凝胶（FeHA-IDA）。FeHA-IDA显示出对间皮细胞系优异的生物相容性。最重要的是，FeHA-IDA可以大幅减少大鼠侧壁缺损-肠道磨损模型中的黏连形成。

5.4 骨关节炎治疗

骨关节炎（OA）是一种全球性关节疾病，主要是由机械应激、促炎细胞因子和基质降解蛋白酶破坏细胞外基质（ECM）而引起的，这种疾病已经成为50岁以上患者生活质量降低的最主要原因之一[122, 123]。关节润滑是降低两个关节表面之间的摩擦力并减少关节磨损的重要措施，关节润滑剂已经成为治疗骨关节炎的关键成分。许多研究者针对软骨中的摩擦和磨损过程以及润滑机理进行了深入探究[124]，关节液中的成分（如润滑素、脂质和HA）在关节润滑中发挥着重要作用，特别是其中的HA，由于具有独特的黏弹性，有助于改善润滑液的润滑作用。当高分子量HA以高浓度溶解时，HA分子通过链内和链间相互作用形成物理交联的分子网络。在HA网络中，一条HA链的疏水区可与另一条HA链的疏水区可逆地相互作用，表现出与单个HA链不同的性质。当长时间施加应力时，HA链缓慢移动并在网络中排列整齐，表现出黏性特性，HA链还能在短时间内抵抗快速应力并恢复到原始状态，表现出弹性性质[125]。此外，HA可以与组织表面的蛋白质润滑素相互作用[126]。

图16显示了软骨中HA/润滑素复合物用于关节润滑的作用机理示意图[127]。HA作为

关节中的电流体动力和边界润滑剂，可以避免关节磨损。当施加生理压力时，通过在狭窄区域中的HA来减少软骨组织的变形。具体而言，与润滑素复合的HA分子在低压下松散地缠结并在胶原和滑液中延伸，而在高负荷压力下，由负载和剪切力引起的组织变形可以诱导在狭窄区域胶原网络中的HA提供额外的磨损保护。因此，关节润滑用HA治疗旨在增强关节中滑液的黏弹性。

图16 HA在低压（左）和高压（右）条件下，在关节接触区域的作用机制示意图[127]

Fig. 16 Schematic illustration for the “mechanical trapping mechanism” of HA in the joint contact area during the physiological sliding under low （left）

and high （right） pressure[127]

(a) The pore structure of cartilage is formed by counter spiraling collagen

fibril coils (blue and green). When undeformed,the lateral pores (void space between fibril “coils”) are open and the entangled HA molecules (yellow),with attached Aggrecans (red) are nominally “free ” ; (b) In compression,fibril realignment mechanically traps (white arrows) the HA/Aggrecan complexes in the

collapsing lateral pores,maintaining a layer of immobilized HA between the collagen and top surface. (c and d) Schematic representation of HA trapping mechanism in the cartilage contact during physiological sliding under low; (c) and

high (d) loads. For clarity,only the HA-LUB layer from the lower surface was

shown.

随着OA的恶化，HA的分子量和浓度降低，滑液的黏度变得太低而不能润滑关节

[128, 129]。由于滑液的降解不能提供润滑作用，从而导致关节疼痛[130]。通过向关节腔内注射

游离HA用于减轻关节疼痛已经得到了广泛应用。关节内游离HA可以减震、促进蛋白多糖合成和提供关节润滑[131]。特别是高分子量的HA对于减少摩擦和吸收冲击非常有用。除天然HA外，润滑脂修饰的HA可以提供更高的磨损保护[126]。现在已经开发了许多HA制剂用于OA的临床治疗。来自生物发酵的HA是高纯度物质并且不含任何致敏蛋白，并且已经以商品名Sinovial®、Adant®、Arthrum®、Durolane®、Euflexxa®、Fermathron®、Jointex®和 Hyalubrix®实现了商业化应用。不同分子量的HA具有不同的关节润滑效果。相对较低重均分子量的HA（5×105～10×105）对于减轻滑膜炎症是有效的，而高重均分子量HA（5×106～10×106）具有黏弹性。低分子量HA的代表性产品是 Sinovial®（8×105～12×105）和 Hyalgan®（5×105～7×105），高重均分子量 HA 的典型产品是 Synvisc®（6×106）。

然而，在生理条件下，HA通过酶或者水解反应迅速降解，从而导致HA在体内被迅速清除[38]。来自临床实验的结果证明，HA的功效很大程度上取决于HA的分子量。现在有

很多HA商品化的产品包括相对低分子量的HA制剂（Hyalgan和ARTZ），中等分子量但低于正常关节液中的HA制剂（ORTHOVISC），以及高分子量的交联HA（Hylan，SYNVISC）。现有证据表明，OA治疗期间注射HA唯一的潜在危险就是关节感染、无菌性关节炎和炎症[132]，而且其毒副作用直接依赖于注射次数。尽管采用低分子量HA制剂治疗骨关节炎似乎是有效的，但是相对低分子量的HA制剂需要更多的注射次数，这可能导致更高的成本和感染机率。为了延长HA在关节炎中的治疗效果并降低由于多次注射引起的感染风险，现在有研究者通过化学交联HA形成水凝胶来延长降解时间，提高治疗效果。Barbucci等

[132]合成了

HA新型水凝胶，通过控制化学计量反应和条件来预测最终所需的交联度，从而

获得具有高度可再现特性的凝胶。在一系列基于HA的水凝胶中，他们选择交联度50%的水凝胶（Hyal 50%）研究其潜在应用价值。在OA治疗中，他们研究了HA水凝胶的流变行为，特别研究了HA水凝胶是否具有可注射性。体内实验证明HA水凝胶对兔膝关节中软骨缺损具有治疗效果。

图17 HA流动凝胶的制备及骨关节炎治疗示意图[133]

Fig. 17 Schematic representation of the formation of HA-based

viscosupplements for osteoarthritis treatment[133]

为了进一步克服HA在关节腔内快速降解问题以及商品化的HA凝胶生物相容性低等问题，本课题组基于乙烯基砜改性的HA与巯基功能化的PEG，通过点击化学方法制备了一种新型的、高度生物相容性的HA凝胶（HA-VS / SH-2-PEG）[133]。将 HA-VS / SH-2-PEG 微凝胶添加到 HA 溶液中制得具有黏弹性可调和、降解速率可控的可注射流动凝胶（图17）。可注射流动凝胶表现出增强的黏弹性性能、较高的润滑性能与药物（曲安奈德）负载能力、良好的抗降解性能、高度的生物相容性以及体内抑制骨关节炎恶化的能力。总体而言，此流动凝胶为骨关节炎的临床治疗提供了技术指导及研究方向。

6 结 论

随着对HA在人体中作用的日益了解，HA在许多生物学与病理学过程中的重要作用被不断揭示。由于HA具有独特的黏弹性、持水性、生物相容性、非免疫原性以及靶向性，自被发现80余年来，在诸多领域特别是生物医药领域受到了广泛关注与应用。HA分子中含有羟基、羧基和乙酰氨基等官能团，通过化学修饰可制备得到HA衍生物以及HA基生物材料，进一步扩大了HA的应用领域和范围。由于癌细胞表面含有大量HA受体，基于这一特点可以利用HA构建不同类型的药物载体用于靶向药物治疗。

然而需要指出的是，之所以HA及其衍生物被广泛应用于药物释放领域，主要是利用其对癌细胞上的CD44受体具有高度靶向性，因此当化学修饰HA时，继续保持其对CD44受体特异性结合能力尤为重要。由于HA分子链与CD44的特异性结合最少涉及6～8个糖单元[134]，对HA的过度化学修饰可能会改变其生物学功能。本课题组研究表明[135]，35%的羧基被取代后的HA仍能保持结合CD44的能力，但68%的羧基被取代的HA则失去了其CD44靶向性。目前，详细研究化学修饰对HA与CD44之间相互作用影响的文献尚不多。考虑到羧基对于保持HA独特生物学功能的重要性，必须确保改性HA衍生物制备的纳米材料具有CD44靶向性。分子量过低的HA会引发炎症等副作用的问题也需得到重视

[16]。此外，利用

HA来修饰一些功能性无机纳米材料（如磁性纳米粒子、量子点、碳点、

石墨烯及其衍生物、碳纳米管、介孔二氧化硅等）的研究，近些年也有了很大进展。这类杂化材料的水分散性和生物降解性得以改善，毒性也得以降低并被赋予了靶向性，更能满足药物传递的严格要求[40]。

HA独特的生理功能也使得HA基材料在组织工程中得到了广泛应用，包括伤口愈合、软骨再生、术后防黏连和骨关节炎治疗等。需要特别指出的是，尽管HA作为基础材料在生物医药中的应用已有数十年的研究和探索，但是目前对HA基材料的细胞功能及其作用机制的认识仍然十分缺乏，HA在动物体中的功能和作用机理尚有待进一步揭示。如HA在不会患癌裸鼹鼠脏器内的多级结构和特殊功能受到重视。HA在脏器内形成高度折叠的结构，而且其特征形态取决于组织类型。裸鼹鼠皮肤中的HA形成紧密包装的组件，除了对水具有很强的亲和力外，还具有类似于弹簧的力学性能。裸鼹鼠脑中的HA形成3维折叠结构，类似于人脑的回球和沟的外观。裸鼹鼠肺中的HA形成了无法折叠的交织网眼，其形态类似于雪人。另外，HA是非凝胶多糖，但HA在裸鼹鼠体内不需化学交联便能形成强凝胶，脱水或反复加载后，HA凝胶从黏弹性急剧转变为类弹性物质[136]。尽管已经认识到这些形态各异的HA在裸鼹鼠抗癌中起到根本作用[137]，但HA在裸鼹鼠不同脏器内的精细聚集体结构和分子构象及形成机理尚不清晰。因此，了解HA在正常和疾病环境中的作用及其潜在机制可能为开发针对这些疾病的HA基材料提供新思路和新技术途径。此外，在某些医疗应用领域，如骨关节炎外源性黏弹性补充治疗和术后防黏连，由于并不要求HA材料具有超高力学性能和超长稳定性，这使得不需化学改性和交联，仅由物理改性和交联（如采用冻融法处理）能完全保留HA自身功能性和特性的生物材料的开发成为可能。这类物理交联的生物材料在使用安全性方面具有优势。