(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103965177 A(43)申请公布日 2014.08.06
(21)申请号 201410194389.8(22)申请日 2014.05.09
(71)申请人南京中医药大学
地址210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道
138号(72)发明人王欣之 王天麟 文红梅 李伟
杨帆 刘睿(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人李纪昌 唐循文(51)Int.Cl.
C07D 407/14(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图1页权利要求书1页 说明书4页 附图1页
(54)发明名称
一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法(57)摘要
一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，首次涉及一种具有抗肿瘤活性的天然产物草胡椒素E(peperomin E)的半合成方法。以中药石蝉草全草中提取得到草胡椒素A(peperomin A)为原料，经过苯硒基亲核取代和氧化脱苯硒基两步得到草胡椒素E，再经硅胶柱层析精制得到纯度大于99.0%的草胡椒素E精品。
CN 103965177 ACN 103965177 A
权 利 要 求 书
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1.一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，其特征在于包括以下步骤：（1）以草胡椒素A（I）为原料，先加入其10-20倍摩尔量的三乙胺搅拌，再加入10-20倍摩尔量的三氟甲磺酸三甲硅酯搅拌，最后加入含2-8倍摩尔量的苯硒基氯的氯仿溶液搅拌，全程控温为0℃，且在氮气保护下进行反应；在上述反应液中加入饱和氯化铵溶液，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液并回收乙酸乙酯，浸膏用硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，得（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）纯品；
（2）在温度为0℃下，用四氢呋喃溶解（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）后加入冰醋酸搅拌，所述冰醋酸为（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）的1.5-6倍摩尔量，再加入质量分数为30%过氧化氢溶液继续搅拌，所述30%过氧化氢溶液为（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）的1.5-6倍摩尔量；将上述反应液移至室温，加入饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，再用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后回收乙酸乙酯，浸膏用硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，得高纯度产物草胡椒素E（III）。
2.根据权利要求1所述一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，其特征在于：步骤（1）所述的三乙胺、三氟甲磺酸三甲硅酯、苯硒基氯与原料草胡椒素A（I）优选摩尔比为（13-15）:（11-12）:（4-5）:1。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，其特征在于：步骤（1）所述洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为4:1。
4.根据权利要求1所述一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，其特征在于：步骤（2）所述的冰醋酸、30%过氧化氢溶液与（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）优选摩尔比为3:（3-4）:1。
5.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，其特征在于：步骤（2）所述洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1。
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说 明 书
一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法
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技术领域
[0001]
本发明属于药物合成领域，涉及一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方
法。
背景技术
[0002] 草胡椒素E是从抗肿瘤中药石蝉草(Peperomia dindygulensis Miq.)中发现的含有α-亚甲基-γ-丁内酯环的裂木脂素类化合物（JL Wu, N Li, T Hasegawa, et al. Bioactive secolignans from Peperomia dindygulensis. Journal of Natural Products, 2006, 69: 790-794），结构式如下：
研究发现，裂木脂素类化合物均具有不同程度的抑制肿瘤细胞增殖的作用，其中以草胡椒素E为代表的含有α-亚甲基-γ-丁内酯环基团的化合物活性最强。体外活性研究表明，草胡椒素E对人肺癌细胞系WI-38、 VA-13和A549，人乳腺癌细胞系MCF-7，人宫颈癌细胞系HeLa，人急性早幼粒白血病细胞系HL-60以及人肝癌细胞系HepG2有较强的细胞增殖抑制作用，IC50值范围在1.2- 12.1μM之间（JL Wu, N Li, T Hasegawa, et al. Bioactive secolignans from Peperomia dindygulensis. Journal of Natural Products, 2006, 69: 790-794; S Xu, N Li, MM Ning, et al. Bioactive compounds from Pepermia pellucida. Journal of Natural Products, 2006, 69, 247-250；徐苏. 草胡椒和毛叶豆瓣绿化学成分与药理活性研究. 2006,中科院上海药物研究所优秀硕士毕业论文: 49）。除此而外，申请人所在实验室发现草胡椒素 E对人胃癌细胞系SGC-7901，人食管癌细胞系Eca-109，人肝癌细胞系SMMC-7721亦具有较强的细胞增殖抑制活性，IC50值在1.5-9.2μM 之间；而对人胃正常黏膜细胞GES-1以及人肝正常细胞L-02无明显的细胞毒作用，提示其对肿瘤细胞与正常细胞之间存在着选择性。通过进一步的研究，我们首次发现草胡椒素E抗肿瘤的机制与其诱导肿瘤细胞凋亡作用有关，同时发现肿瘤细胞线粒体膜电位随着其药物浓度的升高而逐渐下降，表明草胡椒素E诱导肿瘤细胞凋亡可能与线粒体途径相关。综上所述，草胡椒素E活性高、抗癌谱广、无明显体外毒性，有望成为新一代抗肿瘤药物的先导化合物。[0003] 目前，草胡椒素E只能通过传统的分离纯化手段从石蝉草药材中获取，由于该化合物在药材中含量很低，某些产地的药材甚至检测不到，且分离纯化方法复杂、成本较高，产品纯度较差，这成为了制约其深入研究的重要因素，同时制约了该抗肿瘤先导化合物的进一步药用研究。因此，要想对草胡椒素E进行进一步的深入研究，必须首先拓展草胡椒素
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E的来源。为了解决草胡椒素E的来源问题，我们首次试图以草胡椒素A为原料，通过半合成法来制备获得草胡椒素E。
发明内容
[0004] 解决的技术问题：为解决现有技术问题，本发明提供了一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法。[0005] 技术方案：一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法，包括以下步骤：
（1）以草胡椒素A（I）为原料，先加入其10-20倍摩尔量的三乙胺搅拌，再加入10-20倍摩尔量的三氟甲磺酸三甲硅酯搅拌，最后加入含2-8倍摩尔量的苯硒基氯的氯仿溶液搅拌，全程控温为0℃，且在氮气保护下进行反应；在上述反应液中加入饱和氯化铵溶液，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液并回收乙酸乙酯，浸膏用硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，得（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）纯品；
（2）在温度为0℃下，用四氢呋喃溶解（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）后加入冰醋酸搅拌，所述冰醋酸为（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）的1.5-6倍摩尔量，再加入质量分数为30%过氧化氢溶液继续搅拌，所述30%过氧化氢溶液为（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）的1.5-6倍摩尔量；将上述反应液移至室温，加入饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，再用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后回收乙酸乙酯，浸膏用硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，得高纯度产物草胡椒素E（III）。[0006] 作为优选的是，步骤（1）所述的三乙胺、三氟甲磺酸三甲硅酯、苯硒基氯与原料草胡椒素A（I）摩尔比为（13-15）:（11-12）:（4-5）:1。[0007] 作为优选的是，步骤（1）所述洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为4:1。[0008] 作为优选的是，步骤（2）所述的冰醋酸、30%过氧化氢溶液与（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A（II）摩尔比为3:（3-4）:1。[0009] 作为优选的是，步骤（2）所述洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为2：1。[0010] 有益效果
本发明半合成草胡椒素E的方法是以石蝉草中含量丰富的草胡椒素A（I）为原料，方法简单，条件温和，产率好，终产物纯度达到99.0%，大大的拓展了草胡椒素E的来源，为该化合物进一步的抗肿瘤药用开发提供了坚实的基础。
附图说明
[0011] 图1为一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法的第一步流程图；
图2为一种抗肿瘤活性天然产物草胡椒素E半合成方法的第二步流程图。具体实施方式
[0012] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0013] 实施例1
（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)的制备将草胡椒素A（I）（5g，12mmol）溶于三乙胺中（22.5mL，162mmol），0℃搅拌10min后
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加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯（25mL，138mmol），继续0℃搅拌40min后，加入含苯硒基氯（9.5g，50.0mmol）的氯仿溶液（50mL），0℃搅拌反应30min，反应全程在N2气保护下进行。反应液中加入500mL饱和氯化铵溶液后，用乙酸乙酯（800mL）萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比4:1）]精制，得（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)（5.95g，产率87%）：m.p. 77-79oC；[α]20D +50.1（c 0.40, CHCl3）; ESI-MS m/z 593.0676 [M+Na]+ , 1H-NMR δH 7.60(2H, m, m-PhSe), 7.39(1H, m, p-PhSe), 7.29(2H, m, o-PhSe), 6.45(1H, br s, H-6’), 6.53(1H, br s, H-2’), 6.62(1H, br s, H-2”), 6.68(1H, br s, H-6”), 5.93-5.95(4H, m, -OCH2O-), 4.13(1H, d, J=11.7Hz, H-5), 4.02(1H, dd, J=9.6, 7.5Hz), 3.95(3H, s, -OCH3), 3.92(3H, s, -OCH3), 3.71(1H, dd, J=9.6, 11.3Hz), 3.06(1H, m, H-3), 1.15(3H, s,
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H-6)；C-NMR δC 176.4(C-1), 149.5, 149.2 (C-3’,3”), 143.7, 143.4(C-5’,5”), 135.9, 135.8(C-4’, 4”), 108.9, 107.8(C-6’, 6”), 102.0, 101.2(C-2’, 2”), 101.5(-OCH2O-), 124.6(PhSe), 138.3(m-PhSe), 129.9(p-PhSe), 129.1(o-PhSe), 68.7(C-4), 57.0(-OCH3), 52.3(C-5), 52.1(C-3), 50.9(C-2), 23.6(C-6)。[0014] 草胡椒素E（III）的制备
将（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II) (4g, 7.2mmol) 溶于四氢呋喃中（72mL），加入冰醋酸（1.2mL，21.2mmol）, 0℃搅拌10min后加入30%的过氧化氢溶液（3mL，23.2 mmol）继续0℃搅拌反应40min。反应液中加入饱和氯化钠溶液（400mL）后，乙酸乙酯（640mL）萃取3次，合并萃取液，用适量的饱和碳酸氢钠溶液（1000mL）洗涤两次后回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比2:1）]精制，得草胡椒素E（2.76g，产率93%），产品纯度为99%：ESI-MS m/z 435.1041 [M+Na]+ ; 1H-NMR δH 6.456, 6.442（s, H-6’, 6”, 2H）, 6.38, 6.37(s, H-2’, 2”, 2H), 6.15(d, H-6a, J=1.8Hz, 1H), 5.93(s, 4H, -OCH2O-), 4.94(d, H-6b, J=1.5Hz, 1H), 4.32(dd, H-4a, J=7.5, 9.3Hz, 1H), 3.94(dd, H-4b, J=4.2, 9.3Hz, 1H), 3.89(3H, s, -OCH3), 3.90(3H, s, -OCH3), 3.74(m, H-3, 1H). 13C-NMR δC 170.4(C-1), 135.9(C-2), 124.7(C-6), 134.4, 134.3(C-1, 1”), 149.4, 149.6(C-3’, 3”), 143.7, 143.5(C-5’, 5”), 136.1, 136.2(C-4’, 4”), 108.2, 108.4(C-6’, 6”), 101.7, 101.2(C-2’, 2”), 101.5(-OCH2O-), 42.5(C-3), 55.3(C-5), 56.9, 57.0(-OCH3), 69.7(C-4)。[0015] 实施例2
（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)的制备将草胡椒素A（I）（15g，36mmol）溶于三乙胺中（70mL，0.50mol），0℃搅拌10min后加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯（80mL，0.44mol），继续0℃搅拌40min后，加入含苯硒基氯（30g，0.16mol）的氯仿溶液（150 mL），0℃搅拌反应30 min，反应全程在N2气保护下进行。反应液中加入1000mL饱和氯化铵溶液后，用乙酸乙酯（1.5L）萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比4:1）]精制，得（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)（16.9g，产率82.4%）。[0016] 草胡椒素E（III）的制备
将（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II) (10g, 18mmol) 溶于四氢呋喃中（180mL），加入冰醋酸（3mL，53mmol）, 0℃搅拌10min后加入30%的过氧化氢溶液（7.5mL，58mmol）继
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续0℃搅拌反应40min。反应液中加入饱和氯化钠溶液（800mL）后，乙酸乙酯（1.5L）萃取3次，合并萃取液，用适量的饱和碳酸氢钠溶液（2L）洗涤两次后回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比2:1）]精制，得草胡椒素E（6.8g，产率91.7%），产品纯度为99%。[0017] 实施例3
（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)的制备将草胡椒素A（I）（200g，0.48mol）溶于三乙胺中（1000mL，7.2mol），0℃搅拌20min后加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯（1000mL，5.5 mol），继续0℃搅拌40min后，加入含苯硒基氯（400g，2.08mol）的氯仿溶液（1000mL），0℃搅拌反应40 min，反应全程在N2气保护下进行。反应液中加入8 L饱和氯化铵溶液后，用乙酸乙酯（10L）萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比4:1）]精制，得（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II)（219.2g，产率80.1%）。[0018] 草胡椒素E（III）的制备
将（3R，4R）-2-苯硒基草胡椒素A(II) (100 g, 0.18mol) 溶于四氢呋喃中（1000m L），加入冰醋酸（30mL，0.53mol）, 0℃搅拌30min后加入30%的过氧化氢溶液（80mL，0.62mol）继续0℃搅拌反应60 min。反应液中加入饱和氯化钠溶液（5 L）后，乙酸乙酯（8L）萃取3次，合并萃取液，用适量的饱和碳酸氢钠溶液（10L）洗涤两次后回收乙酸乙酯，硅胶柱层析[200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯（体积比2:1）]精制，得草胡椒素E（66.5g，产率89.7%），产品纯度99%。
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说 明 书 附 图
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