动态浊度法测定复方苦参注射液中细菌内毒素

ｌ１８　内蒙古中医药　动态浊度法测定复方苦参注射液中细菌内毒素　朱英花’　朱其兵　摘要：目的：建立定量检测复方苦参注射液中细菌内毒素试验方法。方法：采用《中国药典｝２００５年版（三部）附录检测细菌内毒素的动态　浊度法。结果：复方苦参注射液用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响，内毒素回收率在５０％－２００％范围内。结论：使用动态浊度法定量　检测复方苦参注射液的细菌内毒素是可行的，．－ｊ－￣细菌内毒素方法代替兔热原检查法，同时又避免了限量法内毒素检测时的干扰。　关键词：复方苦参注射液；细菌内毒素；动态浊度法；干扰试验　中图分类号：Ｒ２８６．０　文献标识码：Ａ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　文章编号：１００６—０９７９（２Ｏ１３）１５—０１１８—０２　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ＺＨＵ　Ｙｉｎｇ－ｈｕａ　ＺＨＵ　Ｑｉ－ｂｉｎｇ　（Ｈｕａｉ＇ａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａｉａｎ　２２３０００，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）　【ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｃｔｅｒｉｌａ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（ＢＥＴ）ｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＢＥＴ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ－ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＥＴ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ＢＥＴ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　５０％ａｎｄ　２００％，Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＢＥＴ　ｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｙｒｏｇｅｎ　ｔｅｓｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．　【ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｒａｄｉｘ　Ｓｏｐｈｏｒａ　Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ—Ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｅｓｔ　复方苦参注射液是苦参和白土芩溶液提取物的灭菌溶液，　准曲线成立。　有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的功能。目前我国药品标准　表１　标准曲线的可靠性（ｎ＝３）　刈注射剂采用家兔法进行热原检查。但复方苦参注射液临床用　量大，且为中药制剂，采用家兔法进行热原检查操作复杂，影响　因素多，而细菌内毒素限值检查又具有较大的干扰性，故选用动　态浊度法测定其细菌内毒素可消除其干扰，结果准确可靠，且对　复方苦参注射液进行添加内毒素回收试验及热原检查的对比试　验，以建立此分析方法。　１　材料与仪器　复方苦参注射液（批号２００６０２０３；２００６０６０７；２００５０９２３；２００６　０１１６，山西金晶药业有限公司）；ｒｒＡＬ试剂（批号２００６０２０８，）Ｌ＝０．０　３ＥＵ・ｍＬ～，规格０．５ｍＬ・Ａｍｐ～，湛江海洋生物制品检定厂）；细菌　２－３干扰试验　内毒素国家标准品（批号２００６—３，７０ＥＵ・Ａｍｐ一，中国药品生物制　２．３．１样品稀释倍数计算［１Ｊ：公式为：ＭＶＤ＝Ｌ・Ｃ・ｈｉ～。Ｌ为复方苦　品检定所）；细菌内毒素检查用水（批号２００６０２０８，规格１０ｍＬ・　参注射液内毒素限值；Ｃ为１．０ｍＬ・ｍＬ。；ｈｌ为标准曲线的最低　０３１３　ＥＵ・ｍＬ　；计算得复方苦参注射液最大有效　Ａｍｐ－１，湛江海洋生物制品检定厂）；ＢＥＴ～３２Ｃ细菌内毒素测定仪　内毒素浓度０．（天津大学无线电厂）。　２　方法与结果　稀释倍数ＭＶＤ为１６倍。　２．３．２样品溶液配制及干扰试验将复方苦参注射液用内毒素检　２．１细菌内毒素限值的确定【　１：公式为：Ｌ＝Ｋ－Ｍ一，Ｋ为规定的给　查用水依次稀释为２，４，８，１６倍溶液，记为Ａｉ液；同时另取４　药途径，即人每公斤体重每１ｈ最大可接受的内毒素剂量，注射　管，进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加浓度为ｒ￣（４ｘ１）的细　剂为５．０　ＥＵ・ｋｇ。；Ｍ为１ｈ每公斤体重人的最大给药剂量为　菌内毒素标准溶液；作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Ｂｉ　０．００５　ｍＬ・ｋｇ～，计算得样品的内毒素限值Ｌ为０．５ＥＵ・ｍＬ～。　液；分别取上述各液０．１ｍＬ，加入预先加有０．１０ｍＬ　ＴＡＬ试剂的　２．２标准曲线制备及可靠性口１：用细菌内毒素检查用水将内毒素　反应管内，混匀立即插入ＢＥＴ一３２Ｃ细菌内毒素测定仪内进行检　国家标准品进行１０及２倍稀释，最终细菌内毒素浓度分别为　测，其中每一个浓度重复３管，计算回收率。回收率（％）＝（Ｂｉ液　０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、Ｏ．０３１３　ＥＵ・ｍＬ　稀释系列；各取０．１ｍＬ分　内毒素值一Ａｉ液内毒素值）ｘＭ—ｌｘ１００％。结果见表２。　别加到预先加有０．１ｍＬ　ＴＡＬ试剂反应管内，混合均匀，立即插入　３管。结果见表１。　标准曲线：ＬｇＴ＝２．９２８—０．３０３７ＬＧＣ，ｒ＝一０．９９７８。样品的添加内　版规定，表明样品的４个浓度溶液对鲎试剂无干扰影响。　ＢＥＴ一３２Ｃ细菌内毒素测定仪内进行自动检测，其中每一个浓度重复　毒素平均回收率均在５０％一２００％范围内，符合中国药典２００５年　回归方程：Ｌ　＝２．９２８—０．３０３７ＬＧＣ，其中相关系数ｒ－－一０．９９７８；　２．４样品溶液正式试验：分别取４批复方苦参注射液，用细菌内　最低浓度入１＝０．０３１３　ＥＵ・ｍＬ～，空白对照管在检测时间外，故标　毒素检查用水制成４倍稀释液，记为Ａｉ液；同时另取４管进行４　江苏省淮安市中医院（２２３０００Ｊ　２０１３年４月２０日收稿　倍稀释，并在稀释液中添加浓度为Ｍ（４ｋ１）的细菌内毒素标准溶　液，记为Ｂｉ液；分别取上述各液０．１ｍＬ，加入预先加有０．１０ｍＬ　２０１３年第ｌ５期　ｌｌ９　ＴＡＬ试剂的反应管进行检测，其中每一个浓度重复３管，计算回Ｉ邵檀珩４　，结果—致，均为阳性。　收率。结果见表３。　３　讨　论　表２　复方苦参注射液的干扰试验（ｎ＝３）　３．１从复方苦参注射液的干扰试验结果发现：复方苦参注射液　用细菌内毒素动态浊度法检测，由于内毒素回收率在５０％　２００％范围内，表明不存在干扰因素影响，且４批复方苦参注射　液的内毒素含量均在规定限度０．５ＥＵ・ｍｌ　以下。　３．２用传统的家兔法检测细菌内毒素，由于操作复杂，影响因素　多，对试验结果影响很大。利用动态浊度法进行细菌内毒素定量　检测，具有操作简便，结果准确，检测灵敏度高等优点，尤其避免　了由于家兔差异及人为主观判断所出现的假阳性或假阴性结　标准曲线：ｌｇＴ＝２．９２８－０．３０３７１ｇＣ，ｒ＝＿０．９９７８，４批复方苦参注射　果。经过对比试验，样品的细菌内毒素定量检测结果与家兔热原　液的回收率均在５０％～２００％范围内，表明复方丹参注射液在本实　检测结果一致，说明使用细菌内毒素动态浊度法测定复方苦参　验条件下对ＴＡＬ试剂无干扰影响，因此日常检验选用４倍即可。　注射液的细菌内毒素是可行的，可用细菌内毒素定量检查法代　表３　复方苦参注射液正式干扰试验（ｎ＝３）　替家兔热原检查法。　复方苦参注射液用量：①肌注１次２－４ｍｌ，１　１３　２次；②静脉　滴注：１次１２ｍｌ，氯化钠注射液２００ｍｌ稀释，１日１次，全身用药　总量２０ｍｌ／１个疗程，一般２－３个疗程。　参考文献　【１】国家药典委员会．中华人民共和国药典【Ｓ］．三部，北京：化学工　业出版社．２００５，附录ＸＩＸＦ．　【２］ＥＰ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．２０００，４１．　脂肪间充质干细胞的体外培养及其成骨分化　唐宇欣　郭　晶　闺秀娟’　王亚斐　赵旭　王贺　摘要：近年来，脂肪干细胞成为骨组织工程新的研究热点，本文就脂肪干细胞的体外培养和成骨分化进行浅析。　关键词：脂肪间充质干细胞；体外培养；成骨分化　中图分类号：Ｒ３４　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００６—０９７９（２０１３）１５—０１１９—０１　临床上因先天畸形、创伤、肿瘤、炎症等各种原因所致颌骨　诱导液是在培养基中添加Ｂ一甘油磷酸钠，维生素ｃ，地塞米松。　缺损十分常见，给患者在生理、心理等方面都会带来许多不良影　但目前根据一些报道，这些添加物的最适浓度仍有差异　。许多　响。组织工程技术为骨缺损修复开辟了一条全新的途径，在组　因素会影响脂肪干细胞的成骨分化，如性别差异，雄性的ＡＤＳＣｓ　织工程中，种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子　比雌性的ＡＤＳＣｓ体外成骨分化更迅速更高效［４１。　并称为组织工程的三大基本要素。种子细胞是组织工程的核心　３展　望　因素，骨髓基质干细胞是目前组织工程应用最广的干细胞，但其　到目前为止，有很多关于ＡＤＳＣｓ的报道，但仍然有许多不　纯化率低且数量有限，取材时对机体的创伤大，存在医学伦理问　完善的地方，像分离培养需要更标准一致的方法，成骨分化的机　题，因此需要寻找一种新的种子细胞。随着研究的不断深人，脂　制仍然不清楚，这将是以后研究的一个难点，更多有效促进ＡＤ—　肪干细胞逐渐被人们发现并迅速进入种子细胞研究领域，因其　ＳＣｓ成骨分化的方法需要探索，目前，对于ＡＤＳＣｓ临床治疗骨缺　取材方便，来源充足，分离培养简单，易扩增；可自体移植等优　损的报道已很多，虽然治疗的模式和环境都不同，但至少还没有　点，最近已成为新的研究热点。　副作用的报道，说明ＡＤＳＣｓ对临床细胞治疗和骨组织工程都是　１　脂肪干细胞的体外培养　有潜力的，只是许多工作还需要我们去做。　脂肪组织由脂肪细胞组成，包含结缔组织基质，神经组织，　参考文献　血管细胞和免疫细胞。２００２年，Ｋａｔｚ，Ｚｕｋ和他们的同事们首次　【１］ＺｕｋＰ．　Ｚｈｕ　Ａｓｈｊｉａｎ，Ｐ，ｅｔａ￣Ｈｕｍａｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｉｓａｓｏｕｒｃｅｏｆｍｕｌ—　总结了从人吸脂术得到的脂肪中分离出ＡＤＳＣｓｔ　１，他们用的都是　ｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ￣ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，２００２，１３，４２７９－４２９５．　胶原酶消化法，即将取下的脂肪组织剪碎，用Ｉ型胶原酶在３７℃　【２］Ｂｏｑｕｅｓｔ，Ａ．Ｃ．．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ａｄｉ—　中消化１分钟然后通过离心得到ＡＤＳＣｓ。随后，几个研究组开始　ｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，３（２５）：３５－４６．　继续发展和完善分离培养和鉴定ＡＤＳＣｓ的方法【２Ｉ。但到目前为　『３１　Ｈａｔｔｏｒｌ　Ｈ　ｅｔ　ａ１．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ—　止这仍然是最基本的方法。　ｄｅｉｒｖｅｄ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ａｎ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｓｏｕｒｃｅ…．Ｃｅｉｌｓ　２　脂肪干细胞的成骨分化　Ｔｉｓｓｕｅｓ　Ｏｒｇａｎｓ，２００４，１７８：２—１２．　与ＢＭＳＣｓ和ＵＢＣ—ＭＳＣｓ的成骨诱导液相似，ＡＤＳＣｓ的成骨　［４］Ｑｉｎｇ　ｗ．Ｔｈｅ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｂｏｎｅ　ｗｉｔｈ　吉林大学口腔医学院（１３００００）　ＢＭＰ２　ａｎｄ　ＢＭＰ７　ｇｅｎｅ—ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｒａｔ　ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ［Ｊ］．Ｊ　２０１３年１月２０日收稿　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２０１２，（４）：１２５．