组织工程用可生物降解聚合物多孔支架制备方法研究进展

组织工程用可生物降解聚合物多孔支架制备方法研究进展

吴述平,龚兴厚3,张裕刚,周正难,陈　诗

(湖北工业大学化学与环境工程学院,武汉　430068)

　　摘要:可生物降解高分子多孔支架已广泛用作各种再生新组织模板,组织工程要求支架要有着良好的相互连通、高度开放的多孔结构,以实现细胞的增殖和分化。因此,如何把材料加工成满足生物体要求的结构至关重要。本文对最近几年组织工程用高孔隙率三维支架的制备方法进行了综述,并指出了各种方法的优缺点,展望了可降解高分子支架制备方法的发展前景。　　关键词:多孔支架;组织工程;制备方法

近年来,可降解多孔架材料由于组织相容性好、大的表面积和孔隙率有利于组织细胞的生长粘附、降解速率可调等诸多优点,因而在组织工程领域受到了广泛的关注。所使用的材料主要包括:可降解的天然或合成高分子材料、生物陶瓷及它们的复合材料。因为不同组织和器官对支架材料的降解速率、孔隙率、孔尺寸、力学性能等指标要求不同,这就要求科学家们除了选用不同的基体材料外,还要从多孔材料的制备技术着手,通过孔隙率和孔尺寸的精确控制来满足组织工程对降解速率和力学性能等方面的要求。本文对目前广泛使用的多孔支架材料的制备方法进行了综述,并对这些方法所制备的材料的性能进行了对比。

1　组织工程多孔支架的制备方法

1.1　相分离法/冷冻干燥(Phaseseparation/freeze2drying)

在多组分均相体系中,一定的条件会使系统从稳态转变成热力学非稳态,从而趋于多相系统以降低体系的自由能而发生相分离。相分离可分成溶致相分离(SolventInducedPhaseSeparation,SIPS)和热致相分离(ThermallyInducedPhaseSeparation,TIPS)两种方法。因为许多结晶性聚合物在室温下找不到合适的溶剂,所以SIPS方法应用不多。TIPS法是将聚合物溶液体系的温度降低到某一特定温度以下或者提高到某一特定温度以上发生相分离,将聚合物溶液分为富含聚合物和富含溶剂的两相,然后将分离的聚合物溶液经冷冻干燥去除溶剂后得到微孔结构的支架。TIPS法常与冷冻干燥法结合起来使用。实验室的聚合物/稀释剂体系通常为弱相互作用(聚合物与稀释剂相互作用的参数值χ较大),淬冷时一般在L2L相分离的同时伴随聚合物的结晶[1]。其相图如图1所示,以偏晶点Фm(monolecticpoint)为分界点,当体系的聚合物初始浓度<ФL相分离。由于分子热m时,随着体系温度的降低,首先发生L2运动而引起的溶液内部浓度的不均匀,结果使局部位置上的聚合物浓度增加,当温度足够低时,聚合物浓度较高的区域逐渐增大而趋于稳定,即形成聚合物富相,而其它部分的聚合物浓度较低,形成聚合物贫相。随着温度的继续降低,两液相(聚合物贫相和聚合物富相)中聚合物的浓度沿着L2L相分离曲线(图χ值越大,1La1、La2方向)逐渐变化。当聚合物富相组成到达Фm点时,继续降温则聚合物将结晶析出。ФL相分离;χ值越低,则在很大的聚合物浓度范围内几乎只发生S2L相分离[2]。m越大,越可能发生L2

因此相分离形成微孔结构要以TIPS过程的相图为依据,通过选择良性的稀释剂,控制聚合物溶液浓度、体系的冷却速度以及成核剂等因素来制备更加符合要求的多孔支架。

基金项目:湖北工业大学博士启动基金项目(32700122);

作者简介:吴述平(1986-),男,硕士研究生,主要从事高分子复合材料研究;3

通讯联系人,E2mail:xinghoug@yahoo.com.cn.

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对于组织工程支架,涉及相分离的方法有液2液相分离[3～6]、固2液相分离[7～8]和乳化2冷冻干燥[9～11]。

液2液相分离的一般方法是将聚合物溶解在溶剂中,搅拌获得均匀聚合物溶液,加入一定量的活性玻璃或陶瓷粉末,得到的混合物转入烧瓶中超声粉碎。然后将烧瓶在2196℃的液氮环境中冷冻,然后冷冻干燥,最后在真空干燥箱中室温干燥直至恒重[12],这一方法所得材料孔径较均一,且相互连通,但所得到的孔

μm以下)。固2液相分离不需要加入非溶剂,将聚合物溶于溶剂中,降低温度使溶剂在聚合尺寸较小(100

物溶液中结晶,再使溶剂升华或被其它溶剂交换而形成多孔支架。乳化2冷冻干燥首先将可降解聚合物

溶于溶剂中,加入非溶剂形成乳状液,将上述混合物浇铸到模具中,置于液氮中骤冷。然后将支架冷冻干燥,真空蒸发掉溶剂和非溶剂。控制非溶剂的体积分数、聚合物质量比和分子量,制备的支架孔隙率可达

μm。目前TIPS更趋于与其他方法结合来制备性能更加良好的多孔支91%～95%,大孔直径超过200

架,Nakamatsud等[13]结合热致相分离(TIPS)和溶剂交换相分离(solventexchangephaseseparation,SEPS)的方法制备了壳聚糖/壳聚糖2淀粉多孔支架,支架孔径及其微结构由冷冻产生冰晶的物理学过程μm,孔隙率最高可达92.6%。相分离方法简便易行,孔隙率易控制,该法制备支架的孔径范围在1～400于控制,但引入的有机溶剂难于完全去除。

图1　聚合物/稀溶液体系的相图[2]

Figure1　Thephasediagramsofpolymer/diluentsystem

1.2　溶剂浇铸/粒子沥滤法(Solventcastingandparticulateleaching)

生物复合支架的溶剂浇铸可分为聚合物在有机溶剂中的溶解、致孔剂的混合、浇注、溶剂蒸发、沥滤

等几步。经典溶剂浇铸/粒子沥滤技术由Mikos等[14,15]提出,制备出了孔隙率高达93%,孔径可控的组织工程用多孔细胞支架。该技术使用氯化钠[16]、糖类等[17]不溶于有机溶剂的水溶性颗粒作为致孔剂,可用于制备PLLA、PLGA等可溶于有机溶剂(如氯仿和二氯甲烷)的高分子聚合物多孔细胞支架。其制备过程如下:通过筛分获得需要尺寸大小的致孔剂颗粒,将致孔剂颗粒均匀地分散在PLLA的氯仿溶液中,然后浇注在适当的模具中,待氯仿大量挥发后,真空干燥去除混合物中的残余溶剂,即可获得干燥的PLLA/致孔剂复合物。用去离子水浸出复合物中的水溶性致孔剂,真空干燥后,即可获PLLA多孔支架。

溶剂浇铸/粒子沥滤技术对实验设备和实验条件要求较低,支架的空隙大小可通过致孔剂的几何尺寸控制,空隙率可通过致孔剂与聚合物溶液的比例调节,比表面积可由致孔剂大小和空隙率共同调节等诸多优点,溶剂浇铸/粒子沥滤法已成为组织工程用多孔支架的常用制备技术,广泛用于骨、软骨、神经、皮肤组织工程支架的构建。但传统粒子沥滤法也存在诸多不足:支架形状受到的限制(只能制备出厚度不超过2mm厚的多孔膜)、聚合物有可能保留有毒溶剂、孔与孔之间相互连通性差、存在致孔剂残留等问题。为了克服这些缺陷,科学工作者对溶剂浇铸/粒子沥滤技术进行一系列的改进,包括改进工艺和开发出多种致孔剂,如碳酸氢铵[18,19]、冰粒子[20]、聚氧化乙烯[21]、石蜡[22]和明胶[23]等。

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Yang等[16]使用离心技术改进了经典溶剂浇铸/粒子沥滤法,其具体做法是将NaCl与去离子水混合(水含量2%～7%,wt),然后放置在玻璃模具中离心5min,离心获得的盐基质放在烘箱中去除剩下的水

分,得到多孔盐基质。再将多孔盐基质浸渍在PCL/四氢呋喃溶液中,真空条件下使溶液渗入盐基质,得到原始支架。挥发有机溶剂后沥出盐粒子,真空干燥后得到相互连通性良好且孔径均一的PCL三维多孔支架。Ozkoc[24]利用NaCl和聚乙烯醇(PVA)作为致孔剂,采用注塑成型和粒子沥滤结合的方法制备了聚乳酸/有机粘土纳米复合材料多孔支架,体系中调节PLA和PVA的用量,使两者在复合物中呈双连续相,这样沥滤掉PVA和NaCl后,得到了孔径可调、无溶剂参与且连通性好的三维支架,本方法的缺点是加工过程相对复杂,且加工过程中易导致PLA降解。为解决致孔剂残留问题,孙[20]用喷射器把蒸馏水液滴喷射到装有液氮的容器中激冷,制得近球形的冰粒子,采用粒子沥滤2冷冻干燥复合工艺制备了具有良好孔隙结构、较大尺寸且无致孔剂残留的三维块状PLGA多孔支架。利用热水浸泡和明胶涂覆工艺对支架进行增强处理,有效提高多孔支架的力学性能和亲水性。冰粒子不存在致孔剂残留,因此在制备具有良好的生物相容性、无细胞毒性的多孔支架上具有很大的优越性。1.3　固体自由成型技术(SFFT)

固体自由成型技术(Solidfreeformfabricationtechniques,SFFT),也称快速成型技术(Rapidprototyping,RP),它基于离散2堆积原理,能够根据产品的要求在计算机设计出三维模型,或将已有产品的二维图形转换成三维模型,或用扫描仪,例如计算机断层扫描(ComputerizedTomography,CT)或核磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)对已有的产品实体进行扫描,通过层面处理重新构造出三维模型[25]。目前比较成熟的快速成型方法有三维印刷(ThreeDimensionalPrinting,3DP),熔融沉积模塑(FusedDepositionModelling,FDM),分层实体制造(LaminatedObjectManufacturing,LOM),激光选区烧结(SelectiveLaserSintering,SLS),立体平版印刷术(Stereolithography,SLA)等[26]。关于这方面的工作参考文献[25]和[26]已进行了较全面的综述。用SFFT模具间接制备,增强了对支架形状,孔隙度和孔隙结构的控制,包括大小,形状,方向,分支和连通性。快速成型制备的支架具有完全通孔、空隙高度规则、形态与微结构重复性好,利用MRI和CT数据可设计出宏观构造与缺损组织几乎完全相同的三维结构等优点。但快速成型技术首先需要预先制备临时的模具,使用专用的快速成型设备,而且某些快速成型方法还存在材料类型限制、支架机械强度不足、结构不均匀等缺点[27]。1.4　微球烧结(Microspheresintering)

微球烧结是首先利用乳液/溶剂蒸发技术合成陶瓷/聚合物复合微球,然后烧结复合微球形成三维多孔支架。Lu等[28]用W/O/W乳化技术获得PLAGA2生物玻璃复合微球,烧结的微球成柱形结构,能很

μm,机械性能接近松质骨。将复合材料浸入模拟好的集成互通多孔结构,平均孔隙率为40%,孔直径90

体液(Simulatedbodyfluid,SBF)7天,表面形成具有活性的磷酸钙层,且生物玻璃获得了原来两倍的抗压强度。

近来Yao等[29]通过乳化作用合成PLGA/活性玻璃微球,将其加热注入模具中制得三维多孔支架,并证明了复合材料能很好的促进组织骨髓基质细胞转变为成骨细胞。微球烧结法能制备复杂形状的多孔支架,且孔隙率可控,微粒可包裹生长因子,进行可控释放。但孔间相互连通性不好,支架的孔隙率不高,并在制备过程中需要使用有机溶剂。1.5　纤维粘接法(Fiberbonding)

由PGA或PLGA纤维构成骨架的优点是比表面积大,有利于细胞粘附和养分扩散,对细胞存活和生长有利。缺点则是结构稳定性不好,力学性能不够,多用于软组织培养,而不能用于硬组织培养[30]。为了提高支架稳定性能,研究者提出了两种改进方法,一种方法是采用纤维固定技术[14]将PGA纤维网嵌入到PLLA中。首先将PGA和PLLA的混合物加热到两种聚合物的熔点以上,PLLA首先熔融,充满PGA纤维网络所有空洞。PLLA的作用是稳定PGA纤维和防止PGA开始熔融时纤维网络结构塌陷。经一定的热处理,交叉点的PGA纤维熔融后物理结合在一起,选定一种只能溶解PLA的溶剂将其溶解,即可得到高度多孔网状结构。采用这种成纤技术制得的多孔网状结构的孔隙率和孔直径分别高达

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μm。第二种方法是通过喷雾对纤维表面进行涂层处理[31],将PLLA或PLGA溶解于CHCl381%和500

中,将溶液以雾状喷涂到PGA纤维网表面。由于PGA在CHCl3中的溶解性较差,在这一过程中纤维形

态基本保持不变,溶剂挥发后形成涂层。

Lee[32]利用20kV高压电源对PCL溶液进行电镀制备了静电韧带支架,将PCL静电韧带支架浸泡到PluronicF127(PEO2PPO2PEO三嵌段共聚物)水溶液中,真空室温凝胶,对其热处理后进行冷冻干燥。对热纤维粘接处理的PCL静电韧带支架进行表征,同质纤维的平均直径范围在570nm～1350nm。传统热纤维粘接法制备的静电产品,容易出现收缩现象,其原因在于温度致使非晶区分子链松弛。Lee实验中使用了PluronicF127,它是一种低临界溶解温度(LCST)的温敏水凝胶,能阻止热纤维粘接处理过程中PCL支架出现收缩,在保持支架结构稳定中起了重要作用。通过对支架的形态、超微结构分析以及生物力学性能的测量,表明该种热处理方法可提高PCL静电韧带支架的生物力学性能,不会引起任何形态或超微结构的变化,也不会改变总的外形和纤维直径或支架的孔隙度。这种方法可以改进静电生物性能的产品,如血管支架等。纤维粘接是一个重要的器官移植新技术。1.6　气体发泡法(Gasfoaming)

采用溶剂浇铸/粒子沥滤,纤维粘接和相分离制备多孔支架,尽管孔隙率高达95%,孔径范围在20～μm。这些方法的最大缺点是在制备支架过程中需要使用有机溶剂。残留的有机溶剂对移植的细胞500

有害,能抑制很多细胞生物活性因子(如生长因子)的生长。为此,科研工作者采用超临界CO2作为致孔剂的气体发泡法制备高度多孔可生物降解支架[33]。产生支架的相对密度范围从01107到01232,孔间相

μm。气体发泡又可称为压力淬灭法(pressurequench互连通,孔隙度高达89%,孔径范围30～100

method),它不涉及有机溶剂的使用。图2为该方法的简单示意图。

图2　压力淬灭发泡法[33]

Figure2　Thepressurequenchfoamingmethod.

这种方法涉及两个步骤,第一步将聚合物样品放置在压力容器中,通入惰性气体,一般为超临界的CO2或N2,在高压下使其吸附饱和。第二步是将容器压力迅速下降至环境压力,压力的迅速降低导致CO2在聚合物中的溶解度下降,由于气体过度饱和致使气泡成核,随着气泡的增长,聚合物中气体的浓度

下降,直至聚合物Tg高于压力容器温度。这种方法的缺点是产生的泡沫结构大多是闭孔结构,不适合组织工程的应用,为此Wang[34,35]探讨了利用超声波打破泡沫孔壁的可能性,将生物可降解聚合物样品首先发泡,选择合适的孔径的泡沫支架。,然后对支架进行超声。通过比较超声前后的泡沫微孔结构,结果表明,超声波可以大大地改进泡沫支架内部孔隙的连通性,由此可看出固体发泡和超声结合可以被用来制备组织工程用可生物降解多孔支架。Yoon[36,37]采用气体发泡/盐浸的方法制备了高度多孔的PLGA生物支架,也很好的解决了支架结构的闭孔问题。

2　小结与展望

组织工程在临床医学上有着诱人的前景,包括减少对器官捐献的依赖,减少大的外科修复手术,避免

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长期的化疗等。而生物材料在硬组织修复中的应用始于生物惰性材料,在当今临床应用中,这些材料适用于大多数的永久性生物移植,例如髋关节的替代。后来,发展生物材料侧重于具有骨粘接性能的生物活性玻璃和陶瓷[38]。随后紧跟着这一时期的是应用于在分子水平上刺激特定细胞反应的骨组织工程支架生物降解材料的发展[39]。多年来生物材料处理的问题越来越复杂,从离子的相互作用到生长因子的引入;由单纯的合成材料转向具有生物活性和生物降解的合成材料。虽然目前的研究仍集中于生物材料和基质细胞之间的相互作用,但生物医用材料的基础则源自于干细胞的引入。Levenberg等[40,41]在2003年提出干细胞植入支架后,通过干细胞的分化实现局部细胞的功能化。这种新方法可以使支架表面模拟复杂的局部生物功能,并会在不久的将来实现组织和器官在体内和体外的生长。目前关注的中心是干细胞和支架的界面问题,包括生长因子的引入和细胞粘附。本文提到的组织工程多孔支架的制备方法对构建聚合物—细胞复合体具有广阔的应用前景。然而这些方法都存在一些不足,固需对材料和技术进一步改进和完善。目前通过表面改性包括浸渍涂层(slurrydipping)、电泳沉积(electrophoreticdeposition,EPD)以及明胶涂覆(gelatincoating)等方法来提高支架的生物性能,Roether等[42]用浆料浸渍法首先改进了大孔PDLLA泡沫/生物玻璃颗粒的复合材料。单一采用某一种制备工艺往往都会存在不足之处,目前更加趋于多种制备工艺结合的方式来制备生物和力学性能更加良好的多孔支架,如溶胶凝胶2冷冻干燥法[43]、气体发泡/盐浸[44]、气体发泡2萃取法[45]、热致相分离2溶剂萃取[46]、冷冻固定2冷冻凝胶[47]、注塑成型2挤出发泡[48]等方法。只有达到临床医学要求的标准,组织工程才有望广泛应用于器官和组织缺损的修复、重建。

参考文献:

[1]　张翠兰,王志,李凭力,王世昌.膜科学与技术,2000,20(6):37～41.[2]　苏仪,李永国,陈翠仙,李继定.膜科学与技术,2007,27(5):90～94.

[3]　MaquetV,BoccacciniAR,PravataL,NotingherI.Biomaterials,2004,25(18):4185～4194.[4]　BlakerJJ,MaquetV,Jér󰂩meR,etal.ActaBiomaterialia,2005,1(6):643～652.[5]　BoccacciniAR,BlakerJJ,MaquetV,etal.MaterSciEngC,2005,25(1):23～31.[6]　MaedaH,MaquetV,ChenQZ,etal.MaterSciEngC,2007,27(4):741～745.[7]　MaPX,ZhangRY,XiaoGZ,etal.JBiomedMaterRes,2001,54(2):284～293.[8]　ZhangRY,MaPX.JBiomedMaterRes,1999,44(4):446～455.

[9]　WhangK,ThomasCH,HealyKE,etal.Polymer,1995,36(4):837～842.[10]　LeeJE,KimES,KwonIC,etal.ArtifOrgans,2004,28(9):829～839.[11]　SultanaN,WangM.JMaterSciMaterMed,2007,19(7):2555～2561.

[12]　RezwanK,ChenQZ,BlakerJJ,BoccacciniAR.Biomaterials,2006,27:3413～3431.[13]　NakamatsuJ,TorresFG,TroncosoOP,etal.Biomacromol,2006,7:3345～3355.[14]　MikosAG,SarakinosG,LeiteSM,etal.Biomaterials,1993,14(5):323～330.[15]　MikosAG,ThorsenAJ,CzerwonkaLA,etal.Polymer,1994,35(5):1068～1077.[16]　YangQ,ChenL,ShenX,etal.JMacromolSciPhys,2006,45:1171～1181.

[17]　KangHG,KimSY,LeeYM.JBiomedMaterResBApplBiomater,2006,79(2):388～397.[18]　NamYS,YoonJJ,ParkTG.JBiomedMaterResBApplBiomater,2000,53(1):1～7.[19]　RamayHR,ZhangM.Biomaterials,2003,24(19):3293～3302.

[20]　孙浩.骨组织工程用聚乳酸类多孔支架的制备研究.南京:东南大学,2006:1～52.[21]　TsujiH,SmithR,BonfieldW,etal.JApplPolymerSci,2000,75(5):629～637.

[22]　MaZW,GaoYH,GongYH,etal.JBiomedMaterResBApplBiomater,2003,67B(1):610～617.[23]　GongYH,ZhouQL,GaoCH,etal.ActaBiomaterialia,2007,3:531～540.[24]　OzkocG,KemalogluS,QuaedfliegM.PolymCompos,2009,inpress.[25]　和创龙,夏烈文,罗彦凤.生物医学工程学杂志,2004,21(5):871～875.

[26]　DietmarWH,SittingerM,MakarandV.TrendsinBiotechnology,2004,22(7):354～362.[27]　曾文,周天瑞,颜永年.制造业自动化,2005,27(11):27～29

[28]　LuHH,El2AminSF,ScottKD.JBiomedMaterResA2003,64,A:465～474.[29]　YaoJ,RadinS,LeboyPS.Biomaterials,2005,26:1935～1943.

・66・高　　分　　子　　通　　报2010年5月　

[30]　罗丙红,卢泽俭.国外医学生物医学工程分册,2001,24(4):154～158.

[31]　MooneyDJ,MazzoniCL,BreuerC,etal.Biomaterials,1996,17(2):115～124.[32]　LeeSJ,OhSH,LiuJ.Biomaterials,2008,29:1422～1430.[33]　SinghL,KumarV,RatnerBD.Biomaterials,2004,25:2611～2617.[34]　WangX,LiW,KumarV.Biomaterials,2007,27:1924～1929.[35]　WangX,LiW,KumarV.Biomaterials,2007,27:1924～1929.[36]　YoonJJ,KimJH,ParkTG.Biomaterials,2003,24:2323～2329.[37]　YoonJJ,SongSH,LeeDS,etal.Biomaterials,2004,25:5613～5620.[38]　HenchLL,WilsonJ.Science,1984,226:630～636.[39]　HenchLL,PolakJM.Science,2002,295:1014～1017.

[40]　LevenbergS,LangerR.NewYork:AcademicPress,2004,61:113～134.

[41]　LevenbergS,HuangNF,LavikE.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100:12741～12746.[42]　RoetherJA,BoccacciniAR,HenchLL.Biomaterials,2002,23:3871～3879.[43]　XieE,HuY,ChenX,BaiX,etal.ApplSurfSci,2008,25:545～547.[44]　LimMY,GwonHJ,ShinJW.JIndEngChen,2008,14(4):436～441.[45]　SalernoA,GuarnieriD,IannoneM.ActaBiomaterialia,2009,5(4):1082～1093.[46]　GuanJ,FujimotoKL,SacksMS.Biomaterials,2005,26:3961～3971.[47]　HoMH,KuoPY,HsiehHJ.Biomaterials,2004,25:129～138.

[48]　NevesNM,KouyamdzhievA,ReisRL.MaterSciEngC,2005,25:195～200.

TheResearchProgressofFabricationofHighlyPorousBiodegradable

PolymerScaffoldsforTissueEngineering

WUShu2ping,GONGXing2hou3,ZHANGYu2gang,ZHOUZhen2nan,CHENShi

(SchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068,China)

Abstract:Highlyporousbiodegradablepolymerscaffoldshavebeenextensivelyutilizedastemporaltemplatesforregenerationofvariousnewtissues.Ahighlyopenporousstructureofscaffoldwithwellinterconnectedporesisrequiredtoachievecellproliferationanddifferentiation.Therefore,Meetingthestructuresoforganismsisessentialtothepreparationofscaffolds.Fabricationmethodsforthree2dimensional(3D)scaffoldswithhighporosityinrecentyearsarereviewedinthisarticle.Thispaperalsopointsouttheadvangtagesanddisadvantagesofvariousmethodsandpredictstheprospectoffabricationmethodsofbiodegradablepolymerscaffolds.

Keywords:Porousscaffold;Tissueengineering;Fabricationmethods